Búsqueda y análisis de fármacos en modelos de ataxia de Friedreich

Resumen

INTRODUCIÓN Nicholaus Friedreich en 1863, describió una nueva enfermedad del sistema nervioso en tres familias a la que, posteriormente, se le daría el nombre de ataxia de Friedreich. La ataxia de Friedreich es una ataxia espinocerebelosa de inicio precoz con herencia autosómica recesiva. El gen FRDA, localizado en el cromosoma 9, es el responsable de producir dicha enfermedad. Este gen se expande a lo largo de 80 Kb y consta de sietes exones, de los cuales los cinco primeros codifican para una proteína denominada frataxina. La ataxia de Friedreich se incluye en un grupo de enfermedades hereditarias causadas por la expansión de repeticiones de un trinucleótido. Desde que se describió el gen responsable de la enfermedad y, sobre todo, gracias a la generación de organismos modelos para su estudio, se han postulado diferentes funciones para la frataxina, relacionándola con la homeostasis del hierro y la fosforilación oxidativa. A lo largo de la última década se han llevado a cabo diferentes estrategias terapéuticas para el tratamiento de la ataxia de Friedreich, destacando los antioxidantes (idebenona, coenzima Q, mitoQ) ya que la falta de frataxina genera la formación de radicales libres y quelantes de hierro (deferoxamina, análogos de PCIH) porque en pacientes se ha detectado depósitos de hierro. A pesar de la variedad de estrategias terapéuticas utilizadas hasta la fecha, ningún tratamiento parece definitivo, principalmente debido a la heterogeneidad clínica de la enfermedad. En nuestro laboratorio se ha observado la interacción funcional de frataxina con las unidades Sdh1p y Sdh2p de la succinato deshidrogenasa ubicadas en el complejo II de la cadena de transporte electrónico de la levadura S. cerevisiae y las subunidades SDHA y SDHB del complejo II de la cadena respiratoria humana. El complejo II constituye la segunda reacción de oxidación-reducción esencial de la cadena y, para ello, emplea una molécula de dinucleótido flavina adenina (FAD) como aceptor de electrones. Por ello, se decidió estudiar la riboflavina (vitamina B2) como posible tratamiento terapéutico para estos pacientes. Esta vitamina lleva a cabo sus funciones en el organismo en forma de dos cofactores, flavina mononucleótido (FAD) y flavina adenina dinucleótido (FMN). Al mismo tiempo, el desarrollo de modelos animales invertebrados de enfermedades permite su uso para el cribado de fármacos de un modo sistemático e investigar la respuesta y los mecanismos de acción en dichos modelos. Es por ello por lo que nos planteamos el análisis de una quimioteca estandarizada en diferentes organismos modelo y poder detectar posibles compuestos químicos con potencial interés en la práctica clínica. OBJETIVOS I. ANÁLISIS DE LA BIOGÉNESIS DE LOS CLUSTERS Fe/S Análisis de los principales genes participantes en la biogénesis de los clusters Fe/S mediante el estudio fenotípico de animales con silenciamiento frente a estos genes en el modelo C. elegans. II. ESTUDIO DE INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS CON LA FRATAXINA Estudio de la interacción entre la frataxina y la succinato deshidrogenasa de C. elegans mediante la búsqueda de interacciones sintéticas letales. III. CRIBADO FARMACOLÓGICO DE LA QUIMIOTECA PRESTWICK Rastreo farmacológico de una quimioteca comercial analizando el crecimiento y la supervivencia de modelos deficientes en frataxina en C. elegans y S. cerevisiae. IV. EFECTO DEL TRATAMIENTO DE LA RIBOFLAVINA (VITAMINA B2) Análisis del efecto de la riboflavina y sus cofactores fisiológicos en el desarrollo de C. elegans deficiente en frataxina MATERIAL - Organismos modelo Como organismos modelo se eligió Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae. C. elegans es un pequeño nematodo de vida libre que se alimenta principalmente de bacterias. La cepa utilizada es la cepa salvaje arquetipo N2 aislada en Bristol (Reino Unido). El mantenimiento de este gusano en el laboratorio es muy sencillo, puede crecer en placas de agar o medio líquido con E. coli como fuente alimenticia. S. cerevisiae es un hongo unicelular utilizado industrialmente en la fabricación del pan, cerveza y vino. En el laboratorio se puede mantener en distintos medios de cultivo dependiendo del estudio. Se utilizaron 4 cepas; W303 (cepa salvaje), yfh1¿ (cepa mutante de frataxina), sdh1¿ (cepa mutante de la subunidad 1 de la succinato deshidrogenasa) y la cepa doble mutante yfh1¿sdh1¿. - Fármacos Los fármacos empleados en este proyecto son la vitamina B2 (Riboflavina) y sus derivados FAD y FMN. Esta vitamina interviene en los procesos enzimáticos relacionados con la respiración celular en oxidaciones tisulares y en la síntesis de ácidos grasos. También se realiza un rastreo de la quimioteca Prestwick compuesta por 1120 compuestos. MÉTODOS Se realiza un primer rastreo analizando el crecimiento mediante goteos seriados y curvas de crecimiento en S. cerevisisae disolviendo los fármacos en 2 medios de cultivo (YPD y etanol/glicerol). En C. elegans se determina si la cepa transitoria deficiente de frataxina (frh1-RNAi) amplía su supervivencia con estos fármacos. Para ello se prepara in vitro dsRNA de frataxina que es microinyectado en las gónadas de gusanos jóvenes adultos. De esta forma, los gusanos descendientes presentan silenciamiento frente al gen de interés. Posteriormente se cuantifica la supervivencia de los gusanos desde el día que eclosionan hasta que mueren mediante un seguimiento diario. RESULTADOS Y CONCLUSIONES I. Se han identificado las proteínas en C. elegans homólogas a las proteínas descritas participantes en la biogénesis de los clusters Fe/S en S. cerevisiae, excepto las proteínas Isu2 e Isa2, ambas con identidad elevada de secuencia con Isu1p e Isa1p, que no presentaron homología con ninguna proteína descrita en el nematodo. Probablemente fueron suprimidas a lo largo de la evolución por presentar una función redundante. II. Los animales transitorios de C. elegans deficientes en determinados genes de la biogénesis de los clusters Fe/S (B0205.6, Y73F8A.27, Y39B6A. Y45F10D.4) presentaron una letalidad embrionaria muy marcada, con un desarrollo embrionario anómalo. Sin embargo, los gusanos deficientes en otros dos genes de esta biogénesis, R10H10.1 y Y62E10A.6, presentaron un desarrollo embrionario normal mostrando un incremento de la longevidad frente a los controles. La marcada diferencia que mostraron estos gusanos transitorios sugiere que hay genes en esta ruta esenciales para el desarrollo, mientras que hay genes que no presentan una función esencial, al menos en el nematodo estudiado. III. Se han identificado las subunidades SDHA-1 y SDHB-1 como proteínas homólogas en C. elegans de las subunidades Sdh1p y Sdh2p de la succinato deshidrogenasa de S. cerevisiae. Ambas subunidades se encuentran muy conservadas en especies alejadas filogenéticamente. Los gusanos deficientes en la subunidad SDHA-1 presentó una letalidad embrionaria elevada y un aumento en la supervivencia. Los animales deficientes en la subunidad SDHB-1 mostró una letalidad mucho más agresiva y un descenso en la supervivencia. La disminución en la expresión de estos genes podría ser crucial para el desarrollo embrionario en C. elegans. IV. El análisis de letalidad sintética entre FRH-1 y subunidades de la enzima succinato deshidorgenasa sugiere que hay interacción entre la frataxina y el complejo II. Esta interacción está mediada entre FRH-1 y la subunidad SDHB-1. V. En el análisis de cribado, 16 de los 1.120 fármacos de la quimioteca Prestwick mostraron una mejora en el crecimiento por goteo de las cepas de S. cerevisiae yfh1¿ y yfh1¿sdh1¿. Esta mejoría se observó tanto en condiciones de respiración como de fermentación. Tres de estas drogas, deferoxamina, un quelante de hierro, crisina y amrinona se investigaron en los gusanos deficientes en frataxina. Además, se investigó otro quelante de hierro, la deferiprona. Ninguno de estos fármacos produjo una mejoría en el fenotipo de los gusanos frh-1 (RNAi) excepto crisina a la dosis de 100 ¿M. El posible efecto beneficioso de crisina requiere más estudios antes de que se pudiera considerar como un fármaco candidato para ensayos clínicos. VI. El estudio de la riboflavina reveló un efecto positivo en la fisiología de los gusanos deficientes en frataxina. Sus cofactores fisiológicos, FAD y FMN, fueron capaces de aumentar la supervivencia, recuperar el ritmo de la defecación, mejorar la puesta de huevos en la segunda generación y disminuir la sensibilidad a estrés oxidativo que presentan estos animales. Estos resultados apuntan a la riboflavina como un buen candidato para realizar ensayos clínicos en la ataxia de Friedreich. BIBLIOGRAFÍA 1) Campuzano, V., Montermini, L., Molto, M.D., Pianese, L., Cossee, M., Cavalcanti, F., Monros, E., Rodius, F., Duclos, F., Monticelli, A. et al. (1996) Friedreich's ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science, 271, 1423-1427. 2) Gonzalez-Cabo, P., Sanchez, M.I., Canizares, J., Blanca, J.M., Martinez-Arias, R., De Castro, M., Bertranpetit, J., Palau, F., Molto, M.D. and de Frutos, R. 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