Papel del gen ADCK2 en la regulación de la síntesis de coenzima Qde lo clínico a lo molecular

Resumen

Dentro de las enfermedades raras, se agrupan una serie de patologías que tienen en común un mal funcionamiento de la mitocondria y se conocen con el nombre de enfermedades mitocondriales. Aunque por separado son poco frecuentes, en la población general su prevalencia en conjunto es de 1/5000. Las enfermedades mitocondriales se agrupan en una serie de síndromes, uno de los cuales en el síndrome de deficiencia de coenzima Q. El síndrome de deficiencia de coenzima Q puede ser causado por mutaciones en genes que intervengan directa o indirectamente en la ruta de síntesis del coenzima Q. Hasta la fecha se han descrito pacientes con mutaciones en genes que intervienen en la ruta de síntesis del coenzima Q (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ4, COQ6, ADCK3 y COQ9) que originan deficiencias primarias de coenzima Q, y pacientes con mutaciones en genes que no intervienen en la síntesis del coenzima Q (ETF, ETFDH, BRAF y APTX), pero que provocan una deficiencia secundaria de coenzima Q. En el presente trabajo describimos el gen ADCK2 y su producto proteico, un miembro de la familia ABC1 de quinasas atípicas sobre el que prácticamente no hay información publicada. Solo existen estudios ¿in silico¿ que apuntan a una presunta función quinasa y un presunto papel en la ruta de síntesis del coenzima Q. Gracias a la colaboración de nuestro grupo con los grupos de investigación de la Dra. Elpeleg y la Dra. Jackson tuvimos acceso a muestras de fibroblastos de pacientes que portaban mutaciones en el gen ADCK2. Concretamente se trataron de dos hermanos en los que se producía la aparición de un codón de stop prematuro en heterocigosis, uno con un cuadro clínico bastante grave y otro en principio sin sintomatología; y un tercer paciente perteneciente a una familia distinta con una mutación puntual que provocaba el cambio de una prolina por una leucina. Tras una caracterización fenotípica de dichos fibroblastos, usando como control fibroblastos de una persona sana y de otra con deficiencia secundaria de coenzima Q por una mutación en el gen ETFDH, pudimos detectar que en los fibroblastos de todos los pacientes con mutaciones en ADCK2 se producía una deficiencia de coenzima Q. Tras obtener la primera evidencia de una relación entre ADCK2 y coenzima Q, aparte de los estudios ¿in silico¿ ya citados, observamos en dichos fibroblastos una actividad 10 disminuida de los complejos I y II de la cadena respiratoria, un defecto en la ß¿ oxidación de los ácidos grasos y en algunos casos una acumulación de lactato en el medio de cultivo y una menor masa mitocondrial. Todos estos datos nos sugirieron un defecto mitocondrial general. Además, en los fibroblastos con mutaciones en ADCK2 pudimos observar una tasa de síntesis de coenzima Q elevada y, en general, un aumento en la expresión de los genes de la ruta de síntesis de coenzima Q. Para poder demostrar el papel de ADCK2 en la síntesis de coenzima Q apuntado anteriormente, realizamos estudios de sobreexpresión y silenciamiento transitorio de ADCK2 en la línea celular MRC5. Observamos que en células no defectuosas como las MRC5, la sobreexpresión no tenía efectos sobre la síntesis de coenzima Q, pero si el silenciamiento, ya que hacía disminuir la tasa de síntesis de coenzima Q en un 50 %, una prueba directa de que ADCK2 interviene en la síntesis del coenzima Q. Adicionalmente se cuantificó el coenzima Q en la estirpe nula de Saccharomyces cerevisiae para el gen YPL109c, ortólogo a ADCK2, observándose que también tenía un déficit de coenzima Q del 40%. Además de ese déficit de coenzima Q, la estirpe nula, aunque capaz, tenía una leve dificultad para crecer en medios fermentables y mayor aún para crecer en medios no fermentables. También mostraba una actividad disminuida en los complejos I y I+III, pero una ß¿oxidación similar a la estirpe silvestre. Con la sobreexpresión del gen YPL109c y también del humano ADCK2 se pudieron rescatar los niveles de coenzima Q de la estirpe silvestre, demostrando la complementación de ADCK2 en levadura y su papel en la síntesis del coenzima Q. Sin embargo, la actividad de la cadena respiratoria no pudo recuperarse con la sobreexpresión de YPL109c ni ADCK2, indicando que puede tener una función adicional, además de en la síntesis de coenzima Q, quizás como estabilizadora de los supercomplejos, que no se lleva a cabo correctamente con la sobreexpresión. La sobreexpresión de las versiones de YPL109c y ADCK2 que portaban las mutaciones encontradas en los fibroblastos de los pacientes no fueron capaces de recuperar ninguno de los parámetros medidos como defectuosos en la estirpe nula, e incluso en algunos casos empeoraban con la sobreexpresión de la proteína mutada. De forma similar a la complementación de ADCK2 en levaduras, fuimos capaces de recuperar parcialmente la cantidad de coenzima Q en los fibroblastos del paciente 11 con una mutación puntual en ADCK2. Esto se llevó a cabo mediante la transducción de estos fibroblastos con partículas lentivíricas que portaban un vector con el gen ADCK2. Tras la integración del vector en el genoma, la versión silvestre de ADCK2 se expresó de forma permanente junto con la proteína GFP, que nos sirvió como marcador para seleccionar las células transducidas. La recuperación del coenzima Q no pudo ser total, probablemente porque la proteína mutada se continuaba expresando y también hay que tener en cuenta que la inserción del vector es aleatoria, pudiéndose producir nuevas mutaciones en el genoma. Con la recuperación del coenzima Q tanto en la estirpe nula en YPL109c de levadura, como en los fibroblastos del paciente con la mutación puntual en ADCK2, demostramos, de nuevo, la implicación de ADCK2 en la síntesis del coenzima Q. También realizamos una caracterización de ADCK2 a nivel molecular, donde determinamos el perfil de expresión del gen en Mus musculus. Observamos una mayor expresión en los órganos que más dependían del metabolismo aeróbico y que presentaban una mayor cantidad de coenzima Q. También que su expresión en el desarrollo embrionario aumentaba durante la organogénesis y en el momento en que se produce un cambio del metabolismo anaeróbico al aeróbico, con la maduración de la membrana interna mitocondrial. Intentamos buscar la localización de la proteína ADCK2 mediante técnicas de inmunofluorescencia y subfraccionamiento celular, llegando a la conclusión de que la proteína cumplía su función en la matriz o cara interna de la membrana interna mitocondrial, sin poder descartar que también pueda encontrarse en MAMs. En cuanto a la función bioquímica de ADCK2 se descartó el que tuviera una actividad quinasa sobre sustratos susceptibles de ser fosforilados de manera genérica o una función pseudoquinasa sobre quinasas comerciales. Su función específica no ha sido aún desvelada, pero si se trata de una quinasa debe tener actividad sólo sobre su sustrato específico. Tras la caracterización desde el punto de vista clínico y desde el molecular, tenemos claro que ADCK2 interviene en la síntesis de coenzima Q. Es más, debido a que la tasa de síntesis en los fibroblastos de los pacientes está elevada y que la estirpe nula en YPL109c tiene coenzima Q y es capaz de crecer en medios no fermentables, sabemos que ADCK2 no interviene en uno de los pasos catalíticos de la ruta, ya que si 12 fuera así, la ausencia del gen debería acarrear una ausencia de coenzima Q, o su mutación un defecto en la tasa de síntesis, como ocurre con los genes de la ruta de síntesis del coenzima Q, COQ2 y COQ4. Por tanto, ADCK2 debe actuar con un papel regulatorio de la ruta de síntesis y mutaciones en él pueden provocar una deficiencia primaria de coenzima Q, pero que debe ser diferenciada de la causada por mutaciones en los genes catalíticos de la ruta de síntesis (genes COQ), ya que dichas mutaciones provocan la ausencia de coenzima Q en las estirpes nulas de levadura. El término deficiencia primaria indirecta de coenzima Q es el término que proponemos para denominar esta clase de deficiencias de coenzima Q encontrada en los pacientes descritos.