Papel de la n-glicosilación de proteínas en la virulencia de fusarium oxysporum

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis El objetivo general ha sido investigar la N-glicosilación terminal de proteínas en la especie patógena de tomate Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, centrándose en el estudio de una N-acetilglucosamina transferasa (Gnt2) localizada en el aparato de Golgi, y analizando su efecto en la estructura y composición de la pared celular, y el patrón de proteínas de secreción y capacidad de virulencia. La glicosilación es la adición de oligosacáridos a proteínas y lípidos para formar glicoconjugados tras la acción secuencial de enzimas específicas (Alberts et al, 1983). Las etapas conservadas del proceso de N-glicosilación tienen lugar en el retículo endoplásmico, resultando en la síntesis de un oligosacárido común que se transfiere en bloque a residuos de asparragina en las proteínas diana, y van seguidas de la adición y/o eliminación de residuos de glucosa. Las etapas posteriores localizadas en el aparato de Golgi generan una gran variabilidad de glicanos cuya función precisa es aún desconocida (Leal et al, 2010; Munro, 2001). La modificación o deficiencia de estas estructuras puede causar desórdenes y patologías graves (Sparks & Krasnewich, 1993) por alteración de la función y la pauta de secreción de estas glicoproteínas. 2. Contenido de la investigación El análisis in silico del genoma de F. oxysporum ha permitido identificar una compleja familia génica de N-acetilglucosamina transferasas ortólogas a Gnt1 de S. cerevisiae (Yoko-o et al, 2003). Se procedido a estudiar la función y localización de Gnt2, destacando su duplicación génica en el genoma del hongo. La localización subcelular de la proteína Gnt2 se ha llevado a cabo mediante fusión traduccional de la fase codificante de este gen con la correspondiente de la proteína verde fluorescente (GFP), seguido del análisis bioquímico y microscópico de las estirpe silvestre y los mutantes obtenidos. confirmando su presencia en el aparato de Golgi (Chege & Pfeffer, 1990). Para analizar el papel de Gnt2 se han delecionado de manera dirigida ambas copias del gen y se ha caracterizado a nivel estructural, fisiológico y funcional el fenotipo del mutante nulo obtenido. La ausencia de la proteína Gnt2 resulta en menor producción de algunas enzimas líticas extracelulares y del contenido de N-glicanos totales unidos a proteínas de pared. Menor crecimiento en presencia de compuestos tóxicos que interaccionan con la pared celular o la membrana, y mayor sensibilidad a estrés térmico. A nivel intracelular también se observan cambios en la abundancia de proteínas relacionadas con estrés, choque térmico, tráfico intracelular y síntesis de aminoácidos. A nivel patotípico el mutante muestra virulencia reducida en ambos sistemas modelo, animal y vegetal. Los análisis de microscopía electrónica de transmisión no indican diferencias apreciables en la composición química principal de la pared, constituida por ß-glucano-quitina, pero si alteraciones que implican cambios en la morfología celular, originando septos torcidos y mayor adhesión entre las hifas. 3. Conclusiones La proteína deducida Gnt2 pertenece a una compleja familia génica de N-acetilglucosamina transferasas (Gnts) con seis representantes (gnts) parálogos entre sí y ortólogos a GNT1 de Saccharomyces cerevisiae. Se localiza en las cisternas del aparato de Golgi y participa en la maduración y elongación de los N-glicanos de algunas proteínas de pared, así como de otras intra- o extracelulares. Su ausencia afecta directamente a la pared redundando en una disminución de la masa total y menor grado de polimerización de los glicanos unidos a dichas proteínas diana, y alterando las propiedades físico-químicas y su composición glicoproteica en los mutantes. Estos cambios sufridos en el mutante resultan en mayor sensibilidad a compuestos tóxicos que reaccionan con pared y membrana celular, así como en patrones aberrantes de agregación de hifas atribuido al menor contenido de galactofuranosas constituyentes de los N-glicanos de proteínas de superficie , y defectos en septación. La ausencia de Gnt2 altera el perfil proteico de los mutantes causando la desaparición de algunas enzimas de degradación de pared vegetal, de proteínas de detoxificación de compuestos oxidantes y tomatina, de metabolismo de aminoácidos, de matriz extracelular, de remodelación y de biogénesis de pared; estando menos representadas algunas de rutas de secreción, o por el contrario, aumentando otras de respuesta a estrés o del metabolismo del nitrógeno. Estos defectos de N-glicosilación del mutante resultan en mayor sensibilidad al estrés térmico, menor producción de puentes de anastomosis hifal (CATs) y retraso en la colonización del hospedador y en el desarrollo de la enfermedad de F. oxysporum f.sp. lycopersici en plantas de tomate Lycopersicum esculentum, y en larva de la polilla de la cera Galleria mellonella. 4. Bibliografía - Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (1983) Molecular Biology of the Cell, New York: Garland Science. - Chege NW, Pfeffer SR (1990) Compartmentation of the Golgi Complex: Brefeldin A Distinguishes trans Golgi Cisternae from trans Golgi Network. J Cell Biol 111: 893-899. - Leal JA, Prieto A, Bernabe M, Hawksworth DL (2010) An assessment of fungal wall heteromannans as a phylogenetically informative character in ascomycetes. FEMS Microbiol Rev 34: 986-1014. - Munro S (2001) What can yeast tell us about N-linked glycosylation in the Golgi apparatus? FEBS Lett 498: 223-227. - Sparks SE, Krasnewich DM (1993) Congenital Disorders of Glycosylation Overview. In Gene Reviews, Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, Stephens K, Adam MP (eds). Seattle (WA). - Yoko-o T, Wiggins CA, Stolz J, Peak-Chew SY, Munro S (2003) An N-acetylglucosaminyltransferase of the Golgi apparatus of the yeast Saccharomyces cerevisiae that can modify N-linked glycans. Glycobiology 13: 581-589.