Biología molecular y celular de la alteración de la homeostasis del pirofosfato inorgánico en eucariotas

Resumen

El PPi es un componente celular que se genera en muchas reacciones anabólicas de biosíntesis de polímeros y metabolitos (Geigenberger, Hajirezaei et al. 1998; Stitt 1998; Rojas-Beltrán, Dubois et al. 1999; Farre, Bachmann et al. 2001; Sonnewald 2001). Su hidrólisis es esencial para que esas reacciones discurran en la dirección correcta y se regenere el Pi necesario para las reacciones de fosforilación. La hidrólisis del PPi es una reacción bioquímica universal catalizada por pirofosfatasas inorgánicas (PPasas, EC 3.6.1.1). Existen algunos estudios que muestran la necesidad de PPasas para el correcto desarrollo del anabolismo celular (Heinonen et al., 2001), así como el efecto negativo de la deficiencia de estas enzimas tanto en procariotas como en eucariotas. Sin embargo, estos estudios no van más allá de postular que la carencia sPPasa genera parada del crecimiento en procariotas (Escherichia coli) (Chen et al., 1990) y es letal en eucariotas (Saccharomyces cerevisiae) (Giaever et al., 2002). En este trabajo de Tesis doctoral, se ha realizado un estudio detallado del mecanismo molecular de la toxicidad del exceso de PPi producido por la deficiencia en la sPPasa en eucariotas, así como sobre el papel fisiológico y bioquímico de dichas enzimas en los diferentes subcompartimentos celulares en los que se localizan. Objetivos: 1. Determinar el mecanismo fisiológico de la toxicidad por exceso de PPi en el modelo eucariota S. cerevisiae. 2. Analizar la relevancia de la localización núcleo-citosólica de la sPPasa Ipp1p en S. cerevisiae. 3. Expresar heterologamente diferentes sPPasas en S. cerevisiae y líneas celulares de mamífero. 4. Reproducir en la levadura el escenario metabólico del PPi citosólico de células vegetales. Conclusiones: 1. La ausencia de la sPPasa Ipp1p en la levaduras S. cerevisiae con metabolismo fermentativo genera muerte celular por autofagia, siendo uno de los mecanismos implicados el desbalance de la razón NAD+/NADH debido a la inhibición de la síntesis de NAD+ por el exceso de PPi. 2. La ausencia de Ipp1p genera parada del ciclo celular en fase S en S. cerevisiae con metabolismo respiratorio. Esta parada es reversible si se retira el exceso de PPi y se reactiva la sPPasa. 3. Ipp1p es una enzima núcleo-citosólica, cuyos niveles tanto de proteína como de actividad catalítica son menores en el compartimento nuclear que en el citosol. Esta diferencia se debe a una estricta regulación de los niveles proteícos de la Ipp1p nuclear, mediante degradación proteasómica. Esta regulación es dependiente de la actividad catalítica de hidrólisis de PPi y no de los niveles de polipéptido en sí. 4. La alta homología tanto en la conformación espacial del sitio activo, como del mecanismo catalítico, permite intercambiar sPPasas de diversas procedencias y diferentes familias en sistemas modelo eucarióticos como levadura o células de mamífero. 5. La compartimentalización nuclear de Ipp1p permite la eficiente complementación en levadura de la deficiencia en V-ATPasa mediante la expresión de una H+-PPasa localizada en la membrana vacuolar, pudiendo ser este un escenario metabólico del PPi similar al que tiene lugar en células vegetales.