Characterization of citrus rootstocks against growth limiting factors in the mediterranean basin / Caracterización de patrones de cítricos frente a factores limitantes del crecimiento en la cuenca mediterránea

  1. L. Aparicio Durán
Supervised by:
  1. Francisco José Arenas Arenas Director
  2. María Teresa Navarro Gochicoa Director
  3. Jesús Rexach Tutor

Defence university: Universidad Pablo de Olavide

Year of defence: 2023

  1. Agustín González Fontes de Albornoz Chair
  2. María Paz Suárez García Secretary
  3. Alberto Continella Committee member

Type: Thesis

Teseo: 765294 DIALNET


Summary Citrus (Rutaceae family) is one of the most harvested fruits and a major crop worldwide with multiple features of interest, such as flavor or health properties, and it is widely used in the pharmaceutic, food, and cosmetic industries. Nowadays, citrus cultivation has spread to over 140 countries in regions between 40 north-south latitudes, although the Citrus species originate in tropical and subtropical regions of Southeast Asia. China is the largest citrus producer in the world, followed by Brazil, India, Mexico, the USA, and Spain. The Mediterranean basin is an important producing region, with 26 million tons and accounting for 13% of the worldwide production, with Spain being the largest citrus exporter in 2020. Unfortunately, Mediterranean basin citriculture is threatened by the emergence of diseases, such as Huanglongbing (HLB or citrus greening), which is considered the most devasting disease for citrus crops. HLB is caused by Candidatus Liberibacter bacteria and transmitted by Trioza erytreae and Diaphorina citri psyllid vectors, recently located in the Mediterranean basin, although this region remains HLB disease free. Furthermore, citriculture is limited by different abiotic and biotic factors, such as salinity, water stress, boron toxicity, high temperatures, iron deficiency (Fe-chlorosis), Phytophthora spp., among others. In this context, access to tolerant plant material is needed to combat diseases such as HLB, but also to breed crops under other different limiting factors present in the Mediterranean basin. Thus, there is a need to generate knowledge about the behavior of new plant material that can reduce the impact of HLB, together with other plant growth limiting factors. This thesis project has been divided into two sections including the goals to be achieved. Section I assesses different citrus rootstocks against abiotic factors in four Chapters (1-4). Chapter 1 focus on evaluating citrus rootstocks against salinity. Chapter 2 does so against water stress: flooding and drought, while Chapter 3 assesses citrus rootstocks under boron toxicity conditions. Chapter 4 analyzes the iron-deficiency response (Fe-chlorosis). On the other hand, the analyzes carried out in Section II studies biotic factors; specifically, we have researched the response of different citrus rootstocks to foot rot diseases caused by Phytophthora spp. (Chapter 5). Chapter 1 discusses the response of three novel HLB tolerant citrus rootstocks (US942, US897, and X639) under salinity stress, compared to two reference citrus rootstocks: Carrizo citrange and Forner-Alcaide No. 5. For the purposes of our work, four treatments with different salt concentrations (0, 25, 50 and 75 mM NaCl) were applied and chlorophyll index (SPAD), growth and plant symptom parameters, biomass values (fresh and dry weight), root-leaves macronutrients and salt ion (Na+ and Cl-) concentrations were analyzed. The symptoms in leaves due to salt toxicity appeared in all the rootstocks studied due to the increase in NaCl. Likewise, plant growth was altered in all citrus rootstocks studied, except for X639. In contrast, Carrizo citrange and US897 reported the highest salt ion concentration (Na+ and Cl-) in leaves, whereas the lowest Na+ concentration was found in X639. On the other hand, drought and flooding stresses are gradually increasing in recent years, impacting crop production and yield. Citrus producing regions, such as the Mediterranean basin and Florida, are influenced by both water stress conditions. Chapter 2 aims to evaluate six novel citrus rootstocks (UFR-6, B11R5T60, and 2247 x 6070-02-2) with a reported HLB tolerance, comparing them with a common commercial citrus rootstock (Carrizo citrange). For this study, four water conditions were established: Control, Medium Water Stress (MWS), Drought, and Flooding. Chlorophyll index (SPAD), growth in height, relative growth rate, biomass (fresh and dry weight) and plant water status were recorded during the assay. Their response to water-stress was different for each citrus rootstock depending on genotype; Carrizo citrange was negatively affected by all water treatments in the chlorophyll index (SPAD) and biomass production. In contrast, a positive response in SPAD and growth parameter was shown for UFR-6 under MWS and Drought, while B11R5T60 displayed a similar behavior to Control plants under all water stresses, and the response of 2247 x 6070-02-2 under MWS treatment was acceptable except under Drought or Flooding conditions. Chapter 2 results provide useful information about promising citrus rootstocks that are HLB-tolerant against water-stress conditions, where B11R5T60 displayed the best performance. The experimental approach addressed in Chapter 3 deals with Boron (B) toxicity in different citrus rootstocks, a common limiting factor in both arid and semiarid regions, such as different areas in the Mediterranean basin. B-toxicity generates a negative impact on crops, and citrus is deemed to be sensitive to stress. Chapter 3 analysis studied two promising citrus rootstocks (UFR-6 and 2247 x 6070-02-2) compared with Carrizo citrange, a common commercial citrus rootstock. Three treatments with increased B dosages were established (control, 1 mM, and 2.5 mM H3BO3) under greenhouse conditions, and morphological symptoms, chlorophyll index (SPAD), stomatal conductance, relative water content (RWC), and B concentration in leaves and roots were measured. The B concentration increased in plants generating leaves visual symptoms that were different in each citrus rootstock assayed. Carrizo citrange displayed the greatest toxicity visual symptoms and a decrease in its chlorophyll index (SPAD) and stomatal conductance throughout the B-treatment. Nevertheless, UFR-6 and 2247 x 6070-02-2 showed fewer toxicity symptoms than Carrizo citrange and only reduced its parameters under the 2.5 mM H3BO3 treatment. Chapter 3 results are useful for the citrus industry and growers and can be of help with citrus rootstocks selection under B-toxicity conditions. The last chapter of section I, Chapter 4, evaluates the physiological response of eight citrus rootstock to iron-chlorosis. Iron (Fe) is an essential micronutrient for plants; while concentrations thereof are relatively abundant, it is unworkable for crops in calcareous soils. In order to curb iron deficiency and symptoms in crops, growers usually fertilize them using iron. However, this method is not highly effective. This work evaluates six novel citrus rootstocks (UFR-6, B11R3T53, B11R5T49, B11R5T60, CL-5146, 2247 x 6070-02-2) with low HLB incidence against Fe-chlorosis conditions under greenhouse conditions, and compares them against two common citrus rootstocks, i.e. Carrizo citrange and Forner-Alcaide No. 5. To this end, a control treatment and three Fe-chlorosis treatments were established (control in nutritive medium, without Fe, and control + 1 g CaCO3/L pH 8 or 1 g CaCO3/L pH 9). During the assay, above-ground symptoms, chlorophyll index (SPAD) root-stem, and leaves biomass, besides Fe concentration in leaves, were recorded. Results showed Fe-chlorosis symptoms agreed with SPAD values, and a better response compared to the remaining citrus rootstocks 247 x 6070-02-2, and UFR-6. Moreover, almost all citrus rootstocks showed the highest biomass reduction under 1 g CaCO3/L pH 9 condition. In addition, two citrus rootstocks (Carrizo citrange and B11R5T49) achieved the highest concentration of Fe on leaves under control conditions, while the remaining citrus rootstocks reached the highest concentration in different treatments assayed. The results obtained in this study can be useful for citrus growers to address Fe-chlorosis issues with sustainability. Analyzing biotic stresses, Phytophthora spp. is one of the most common soil-borne pathogens in citrus crops, in which Phytophthora nicotianae and P. citrophthora are the most relevant species. Studies performed in Chapter 5 address the response of different citrus rootstocks to Phytophthora spp., oomycetes that cause diseases problems worldwide, such as foot rot and gummosis of the trunk, branch canker, brown rot of fruit, feeder root rot in orchards, and seedling damping-off in nurseries. Chapter 5 aims to determine the susceptibility of new citrus rootstocks with low HLB incidence to Phytophthora diseases. Plants of several commercial and new citrus rootstocks originated in different breeding programs were inoculated with an isolate of P. nicotianae. The post-inoculation damage of lesion length in the stem (DPI) was measured for each plant. After inoculation, different susceptibility was shown for the citrus rootstocks tested. Thus, eleven new citrus rootstocks (B11R3T25, B11R5T25, B11R5T49, B11R5T60, B11R5T64, N40R1T18, N40R1T19, N40R3T25, WGFT + 50-7, UFR-6, and CL-5146), which have not been previously studied against Phytophthora diseases, improved the tolerance effect of Carrizo citrange. The findings obtained in Chapter 5 provide useful information for citrus growers on rootstock selection to address incidence issues caused by Phytophthora spp., with the Phytophthora tolerant citrus rootstock being an essential tool for citrus industry success. Resumen Los cítricos (familia Rutaceae) son una de las frutas cultivadas más importantes del mundo. El éxito de este cultivo se basa en las múltiples características que poseen, entre las que se encuentran su sabor, sus propiedades para la salud y usos en las industrias farmacéuticas, alimentarias y cosméticas. El origen de las especies de los cítricos se localiza en regiones tropicales y subtropicales del sureste asiático, aunque actualmente el cultivo de los cítricos se ha extendido lo largo de más de 140 países comprendidos entre las latitudes 40° norte-sur. China es el mayor país productor de cítricos del mundo, seguido por Brasil, India, México, Estados Unidos y España, y la cuenca mediterránea es una de las zonas productoras de cítricos de las más importantes, produciendo 26 millones de toneladas en el año 2020, lo que supone un 13% de la producción mundial. Dentro de la cuenca mediterránea, España se posiciona como el mayor productor de cítricos alcanzando una producción de 6,69 miles de toneladas en el año 2020. Desafortunadamente, la citricultura de la cuenca mediterránea está amenazada por la emergencia de enfermedades como Huanglongbing (HLB o “Greening” de los cítricos), la cual es considerada como la enfermedad más devastadora de los cítricos. HLB está causada por tres bacterias Candidatus Liberibacter y transmitida por dos vectores psílidos (Trioza erytreae y Diaphorina citri). Recientemente, los vectores T. erytreae y D. citri han sido localizados en la cuenca mediterránea, aunque aún no se ha descrito la presencia de ninguna de las bacterias en esta zona productora. Por otro lado, múltiples factores abióticos y bióticos limitan la citricultura en la cuenca mediterránea. De esta forma, se hace necesario tener información del comportamiento y respuesta del nuevo material vegetal de cítricos disponible que permita poder reducir el impacto del HLB y de otros factores limitantes del crecimiento en la cuenca mediterránea. Este proyecto de tesis ha sido dividido en dos bloques que incluyen los objetivos a alcanzar. En el Bloque I donde se abordan los factores abióticos recogidos en cuatro capítulos (1-4). El Capítulo 1 trata sobre la evaluación de diferentes patrones de cítricos frente a salinidad. El Capítulo 2 recoge la caracterización de patrones frente a estrés hídrico, mientras que el Capítulo 3 los analiza frente a toxicidad por boro. Finalmente, el Capítulo 4 estudia el comportamiento de los patrones frente a la deficiencia de hierro. Por otro lado, los análisis realizados en el Bloque II abordan los factores bióticos, concretamente, se ha evaluado el comportamiento de numerosos patrones de cítricos frente a la podredumbre de cuello causada por Phytophthora spp (Capítulo 5). El Capítulo 1, recoge el estudio de la respuesta bajo condiciones salinas de tres patrones de cítricos (US942, US897 y X639) con tolerancia al HLB comparada con la que presentan dos patrones comúnmente conocidos (citrange Carrizo y Forner-Alcaide No. 5). La evaluación de los patrones se hizo en condiciones de invernadero donde se establecieron cuatro tratamientos en dosis crecientes de sales: 0, 25, 50 y 75 mM de NaCl. Cada quince días se registraron los datos de índice de clorofila (SPAD), crecimiento y síntomas ocasionados por el exceso de sales. Al finalizar el ensayo se registró el peso fresco y seco así como la concentración de Na+ y Cl- en raíces y hojas y la concentración de macronutrientes en hojas. Durante el ensayo, los síntomas en hojas por toxicidad de sales aparecieron en todos los patrones estudiados debido al incremento de NaCl. Así mismo, el crecimiento de los patrones se vio afectado en todos los estudiados excepto en X639. Por otro lado, citrange Carrizo y US897 mostraron la mayor concentración de iones salinos (Na+ y Cl-) en las hojas, mientras que la menor fue registrada por el patrón X639. Por otro lado, el estrés por sequía e inundaciones está aumentando gradualmente en los últimos años, afectando la producción y el rendimiento de los cultivos. Las regiones productoras de cítricos, como la cuenca mediterránea y Florida, están influenciadas por ambas condiciones de estrés hídrico. En el Capítulo 2 de esta tesis se han evaluado diferentes patrones de cítricos tolerantes al HLB (UFR-6, B11R5T60, y 2247 x 6070-02-2) frente a estos estreses, y se han comparado con citrange Carrizo. Para ello, se establecieron en condiciones de invernadero cuatro tratamientos control, estrés hídrico medio (EHM), Sequía e Inundación. A lo largo del ensayo se registraron valores de índice de clorofila (SPAD), el crecimiento en altura y la tasa de crecimiento relativo. Al finalizar el ensayo se recogieron datos de biomasa (peso fresco y seco) y del estado hídrico de la planta. Los patrones estudiados mostraron diferentes respuestas al estrés hídrico dependiendo del genotipo. Citrange Carrizo disminuyó las unidades de SPAD bajo todos los tratamientos de estrés hídricos ensayados. Por el contrario, el patrón UFR-6 mostró una respuesta positiva en sus valores de SPAD y crecimiento bajo los tratamientos EHM y Sequía, mientras que el patrón B11RT60 tuvo un comportamiento similar a las plantas control bajo todos los estreses hídricos estudiados. El patrón 2247 x 6070-02-2 mostró una respuesta adecuada en el tratamiento EHM pero no para los tratamientos de Sequía y de Inundación. Los resultados presentados en el Capítulo 2 proporcionan información útil sobre los patrones de cítricos prometedores, donde B11R5T60 mostró el mejor comportamiento. El enfoque experimental abordado en el Capítulo 3 se ocupa del análisis de diferentes portainjertos de cítricos frente a la tolerancia al exceso de boro (B), un factor limitante común en las regiones áridas y semiáridas, como es el caso de diferentes áreas de la cuenca mediterránea. La toxicidad de B genera un impacto negativo en los cultivos de los cítricos, los cuales se consideran sensibles a la toxicidad de B. En el Capítulo 3 se han evaluado dos patrones de cítricos prometedores para la citricultura (UFR-6 y 2247 x 6070-02-2) y se han comparado con citrange Carrizo. Se establecieron cuatro tratamientos en dosis crecientes H3BO3 (Control, 1 mM y 2,5 mM H3BO3). Durante el ensayo se tomaron medidas de síntomas morfológicos y SPAD. Al finalizar se midió conductancia estomática, RWC y concentración de B en raíces y hojas de los patrones de cítricos. El incremento de B debido a los tratamientos produjo síntomas visuales en las hojas de los patrones de cítricos, los cuales fueron diferentes para cada patrón. Citrange Carrizo mostró mayores de síntomas visuales, una disminución de su índice de clorofila (SPAD) y conductancia estomática a lo largo del ensayo en todos los tratamientos de toxicidad de B. Sin embargo, UFR-6 y 2247 x 6070-02-2 mostraron menos síntomas que citrange Carrizo y solo redujeron sus parámetros bajo en tratamiento de 2,5 mM H3BO3. Los resultados obtenidos en el capítulo 3 son útiles para la industria y los productores de cítricos, y pueden ayudar a la selección de patrones de cítricos en la región bajo condiciones de toxicidad B. El último capítulo del Bloque I, Capítulo 4, recoge la evaluación frente a la deficiencia de hierro de ocho patrones de cítricos. El hierro (Fe) es un microelemento esencial para las plantas, pero a pesar de su abundancia relativa se reduce su disponibilidad para la planta en los suelos calcáreos. Para frenar la carencia de hierro y sus síntomas en los cultivos, los agricultores suelen abonarlos con Fe, aunque este método no es muy eficaz. En el capítulo 4 se han evaluado seis patrones de cítricos novedosos (UFR-6, B11R3T53, B11R5T49, B11R5T60, CL-5146, 2247 x 6070-02-2) con baja incidencia de HLB frente a clorosis férrica, y se han comparado con dos patrones de cítricos comunes como son Citrange Carrizo y Forner-Alcaide No. 5. Para ello se establecieron cuatro tratamientos en condiciones de invernadero (Control en medio nutritivo, Carencia de Fe, Control + 1 g CaCO3/L pH 8 o 1 g CaCO3/L pH 9). Durante el ensayo se han realizado medidas de síntomas de clorosis y de índice de clorofila (SPAD), mientras que al final de ensayo se ha medido biomasa de raíces, tallo y hojas, así como la concentración de Fe en hojas. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron como los datos de sintomatología causada por la deficiencia de hierro y los datos de SPAD coincidían, siendo los patrones de cítricos UFR-6 y 2247 x 6070-02-2 los que presentaban mejor comportamiento comparado con el resto. Además, la mayoría de los patrones estudiados mostraron la mayor reducción de biomasa en el tratamiento con 1 g CaCO3/L pH 9. Por otro lado, los patrones citrange Carrizo y B11R5T49 registraron las mayores concentraciones de Fe en hojas en las plantas control mientras que el resto de los patrones mostraron los valores mayores de concentración de Fe en el resto de los tratamientos. La información obtenida en este capítulo puede ser útil para resolver los problemas de deficiencia de Fe de una manera sostenible. Analizando los factores bióticos, Phytophthora spp. es uno de los patógenos de suelo más comunes en el cultivo de los cítricos, siendo P. nicotianae y P. citrophthora las especies más relevantes. El Capítulo 5 aborda la respuesta de diferentes portainjertos de cítricos frente a Phytophthora spp., oomiceto que causa enfermedades a nivel mundial como la podredumbre del cuello o la gomosis del tronco, chancro de las ramas, aguado o podredumbre de la fruta, podredumbre de las raíces y muerte de plántulas en viveros. El Capítulo 5 tiene como objetivo determinar la susceptibilidad de patrones de cítricos con baja incidencia al HLB a enfermedades causadas por Phytophthora. De este modo, los patrones de cítricos comerciales y novedosos procedentes de diferentes programas de mejora de cítricos fueron inoculados con Phytophthora nicotianae. Tras treinta días de la inoculación y bajo condiciones de invernadero se midió el daño ocasionado por la inoculación en el tallo. Así, se obtuvo una respuesta de los diferentes patrones frente a la podredumbre del cuello, donde once de los patrones estudiados (B11R3T25, B11R5T25, B11R5T49, B11R5T60, B11R5T64, N40R1T18, N40R1T19, N40R3T25, WGFT + 50-7, UFR-6 y CL-5146) mejoraron en este estudio preliminar su respuesta a esta enfermedad en comparación con citrange Carrizo. Los resultados obtenidos en el Capítulo 5 puede ser útiles para realizar la elección del patrón adecuado donde existen problemas ocasionados por Phytophthora spp.