Insights on the structure and dynamics of glycosaminoglycans and their interactions with langerinNMR and computational studies

Resumen

Título oficial: Insights on the Structure and Dynamics of Glycosaminoglycans and their Interactions with Langerin: NMR and Computational Studies Título en castellano: Estructura y Dinámica de Glicosaminoglicanos y sus Interacciones con Langerina: Estudios Computacionales y de RMN La determinación de las estructuras tridimensionales de los oligosacáridos así como la comprensión de las bases moleculares que gobiernan sus interacciones con proteínas representan los desafíos principales de la glicobiología estructural de vanguardia. Además, la determinación de la estructura 3D y de las propiedades dinámicas de los oligosacáridos es un requisito indispensable para lograr un mejor entendimiento de la bioquímica que subyace a sus procesos de reconocimiento molecular y al diseño racional de fármacos tipo carbohidrato. En este sentido, tanto la espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de alta resolución como el modelado molecular (dinámica molecular, docking. etc) representan herramientas esenciales para el estudio estructural de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados. La heparina (HEP) y el sulfato de heparano (HS) son glicosaminoglicanos (GAGs) basados en unidades disacarídicas de repetición constituidas por un residuo de ácido urónico (ácido L idurónico o ácido D-glucurónico, en la región regular de la heparina y sulfato de heparano, respectivamente) unido a un residuo de glucosamina mediante enlace glicosídico 1-4. Ambos GAGs se encuentran extensamente sustituidos por grupos sulfato (la heparina presenta la mayor densidad de carga negativa de toda macromolécula natural conocida) y, al estar presentes en la matriz extracelular, interaccionan con cientos de proteínas, entre ellas las proteínas de membrana. Estas interacciones actúan tanto modulando la actividad de las proteínas como habilitándolas para ejercer su/s función/es, siendo uno de los ejemplos más conocidos la interacción con la antitrombina III, en la que una secuencia pentasacarídica inusual y específica es la responsable de la interacción. Además, el impacto que las interacciones de GAGs con proteínas generan sobre la función de estas últimas juega un papel esencial en el desarrollo, crecimiento y adhesión celular, la tumorigénesis, o las interacciones con patógenos. Un aspecto estructural clave de la heparina (también de la secuencia no regular del HS) es que, aunque presenta un esqueleto muy rígido (estructura global), es a la vez muy flexible a nivel local, debido a la elevada flexibilidad conformacional de los anillos de iduronato, los cuales se encuentran en equilibrio entre las conformaciones de silla 1C4 y bote torcido 2SO. Además, este singular equilibrio conformacional del anillo de iduronato parece estar modulado por el patrón de sulfatación de los residuos adyacentes. La proteína Langerina, una lectina tipo C, transmembrana tipo II, con especificidad por carbohidratos, es expresada casi exclusivamente por las células de Langerhans (LCs) presentes en la epidermis y el epitelio de la mucosa. Dichas células representan un subconjunto de células dendríticas (DCs) con características estructurales muy particulares, como es la existencia de unos orgánulos específicos que no están presentes en ninguna otra célula dendrítica: los gránulos de Birbeck. Precisamente debido a su ubicación (epitelio), estas células de Langerhans constituyen la primera barrera de reconocimiento de patógenos, por ejemplo del VIH-1. A este respecto, en los últimos años se ha demostrado que las células de Langerhans no ejercen la función presentadora de antígenos característica del resto de células dendríticas, sino que primero internalizan las partículas víricas del VIH-1 a través de su interacción con Langerina y posteriormente las degradan en los gránulos de Birbeck. Por tanto, Langerina es capaz de prevenir la transmisión del VIH hacia las células T, evitando así su infección, mediante interacción con la proteína gp120 del virus y posterior internalización en los gránulos de Birbeck para su degradación. Este papel defensivo de Langerina frente al VIH contrasta con el representado por DC-SIGN, también una proteína transmembrana pero expresada en otro subconjunto de células dendríticas, ubicadas a nivel del subepitelio, y que actúa como vehículo de infección de células T. DC-SIGN ha sido objeto de numerosos estudios para el desarrollo de inhibidores y, desde que el papel biológico de Langerina es conocido, todas las estrategias para inhibir DC-SIGN se basan al mismo tiempo en evitar la inhibición de Langerina. Además, se ha demostrado que la formación de los gránulos de Birbeck está mediada por Langerina, y más aún, se ha especulado con que, debido a la extensa presencia de GAGs en el medio extracelular, estos estén igualmente implicados en la formación de estos compartimentos subcelulares mediante interacción con Langerina. Por tanto, la identificación de ligandos naturales y potencialmente fisiológicos de este receptor así como la descripción en detalle de las interacciones GAG-Langerina presenta una enorme relevancia biológica. En este sentido, actualmente es sabido que Langerina interacciona con manosa, glucosamina y galactosa 6 sulfato, y además, con sulfato de queratano (glicosaminoglicano sulfatado del tipo Gal ß(1-4) GlcNAc), posiblemente un ligando fisiológico de Langerina. A partir de estas observaciones, es razonable pensar que otros GAGs sulfatados como la heparina, el sulfato de heparano o el sulfato de condroitina podrían igualmente ser ligandos de Langerina. En la presente tesis doctoral, hemos estudiado a nivel de detalle la influencia del patrón de sulfatación de residuos de glucosamina adyacentes sobre el equilibrio conformacional de un anillo de iduronato interno en derivados trisacarídicos tipo heparina, mediante experimentos de RMN y simulaciones de dinámica molecular, con y sin restricciones experimentales, en agua explícita. Además, se han determinado las estructuras globales y las propiedades hidrodinámicas tanto de estos trisacáridos como de un hexasacárido (tipo heparina). Por otro lado, las características estructurales que definen el reconocimiento de los mencionados trisacáridos, un hexasacárido tipo heparina y disacáridos derivados de ácido hialurónico por Langerina, han sido investigadas a resolución atómica mediante técnicas de RMN de observación de ligando, como son los experimentos basados en NOE transferido (tr NOESY) y la espectroscopía de Diferencia de Transferencia de Saturación (STD NMR), y técnicas computacionales como la dinámica molecular y el docking. Así, se han determinado las conformaciones bioactivas de estos ligandos en el estado enlazado y su orientación en el sitio de interacción del receptor. Además, se han determinado cualitativamente las afinidades relativas de algunos ligandos por Langerina mediante experimentos de STD de competición. Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto el marcado impacto que determinadas modificaciones químicas ejercen sobre el comportamiento conformacional de ácido L-idurónico en oligosacáridos tipo heparina, mientras que la estructura molecular global permanece inalterada. En particular, se ha observado que la 6-sulfatación de los residuos de glucosamina que sustituyen al anillo de iduronato en su posición anomérica da lugar, independientemente de la temperatura, al desplazamiento del equilibrio conformacional de un residuo de iduronato interno hacia los confórmeros ecuatoriales (disminuye la población de silla 1C4), siendo el bote torcido 2SO el mayoritario entre ellos. Además, el mismo tipo de sustitución (6-sulfatación) da lugar a una reorientación molecular más lenta en disolución acuosa. Por otro lado, la ausencia de este grupo sulfato (hidroxilo en su lugar) hace que el equilibrio conformacional del anillo de ácido idurónico sea muy sensible a la temperatura y, además, provoca el efecto contrario a la 6 sulfatación (aumento de la población de silla 1C4) a baja temperatura. Respecto a las características del reconocimiento molecular de Langerina, se ha identificado que la interacción de los trisacáridos tipo heparina y de los disacáridos de ácido hialurónico tiene lugar en el sitio de interacción dependiente de calcio del dominio de reconocimiento para carbohidratos, a través del terminal no reductor. Además, ha sido interesante comprobar que el patrón de sulfatación de los trisacáridos no ejerce influencia alguna ni en su modo de interacción ni en su conformación bioactiva, y por otro lado, que Langerina no reconoce derivados de ácido hialurónico que presentan un anillo de ácido glucurónico como terminal no reductor. De mayor relevancia aún ha sido la observación del cambio en la selectividad de la interacción con Langerina de oligosacáridos tipo heparina de mayor tamaño (hexasacárido), teniendo lugar en este caso el reconocimiento molecular en el sitio de interacción independiente de calcio presente en las interfaces de trimerización de Langerina. Esta tesis doctoral proporciona información estructural y dinámica de relevancia para la comprensión de las propiedades de oligosacáridos de heparina en general y del residuo de ácido idurónico en particular. Además, aporta una descripción en detalle de las bases moleculares que gobiernan las interacciones de Langerina con diferentes glicosaminoglicanos, de enorme interés en el desarrollo de potenciales agentes anti-infecciosos selectivos.