Bases moleculares de la regulación transcripcional de la ruta de degradación del ácido 3 - hidroxifenilpropiónico en escherichia coli

Resumo

En este trabajo se ha caracterizado el regulador implicado en la ruta de degradación del ácido 3-hidroxifenilpropiónico (3HPP) de Escherichia coli K-12. Al comienzo de este trabajo se llevó a cabo la purificación de la proteína MhpR fusionada a una cola de seis histidinas mediante cromatografía de afinidad obteniéndose proteína absolutamente pura y muy concentrada (7 mg/ml). Se ha comprobado su actividad tanto in vivo como in vitro en presencia y ausencia del inductor 3HPP. Hemos obtenido un modelo estructural basándonos en su identidad con un posible regulador transcripcional recientemente cristalizado. Los resultados obtenidos mediante ultracentrifugación analítica sugieren que la proteína podría ser un dímero y un tetrámero en ausencia y presencia de DNA, respectivamente. Mediante ensayos de retardo en gel y experimentos de transcrición in vitro hemos demostrado la actividad de la proteína MhpR purificada. Mediante ensayos de fluorescencia hemos estudiado la interacción de la proteína MhpR con sus diferentes ligandos. Además, mediante dicroismo circular hemos determinado la estructura secundaria, termoestabilidad y aspectos relacionados con la interacción proteína-ligando. Para modificar la actividad de la proteína MhpR y obtener información de los residuos clave implicados en el mecanismo de acción, se introdujeron mutaciones en la secuencia del gen mhpR mediante una técnica de mutagénesis al azar. Aplicando un sistema de selección se han detectado cepas productoras de proteínas MhpR mutantes con su actividad alterada y nos hemos centrado en aquellas que producen proteínas más activas que la proteína nativa. Estas proteínas mutantes han sido caracterizadas por las mismas técnicas empleadas en el estudio de la proteí na nativa. Por otro lado se ha estudiado la regulación global de la ruta de degradación del ácido 3HPP. Mediante ensayos de transcripción in vitro se ha demostrado que la activación del promotor Pr del cluster mhp depende de la presencia de CRP. La unión de CRP al promotor Pr se ha confirmado mediante footprinting con permanganato potásico, cómprobandose además que la presencia de CRP es absolutamente necesaria para la formación de la burbuja de iniciación. También se ha comprobado in vitro el e fecto sinérgico de CRP sobre la transcripción mediada por el promotor Pa. Además, se ha estudiado la proteína transportadora de 3HPP (MhpT). Se ha demostrado que la expresión del gen transportador mhpT del cluster mhp tiene lugar a partir del...