Rga6, una GAP de Cdc42, implicada en el control de la morfología celular de Schizosaccharomyces pombe

Resumen

La morfogénesis constituye junto con el crecimiento y la diferenciación celular, uno de los aspectos más importantes del desarrollo de un organismo. Muchas de las principales moléculas implicadas en el control del crecimiento polarizado y la morfogénesis, como las GTPasas Rho, están conservadas desde levaduras a mamíferos. En nuestro grupo estudiamos el papel de las GTPasas Rho en el crecimiento polarizado empleando como organismo modelo la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Esta levadura posee una morfología cilíndrica y crece por los polos. Su forma, tamaño y división a lo largo del ciclo son muy reproducibles en el laboratorio. Gracias a ello, es un buen organismo modelo para estudiar el control de la morfología celular. S. pombe contiene 6 genes que codifican GTPasas de la familia Rho, Rho1-Rho5 y Cdc42. Cdc42 es esencial para la viabilidad celular. Se localiza tanto en la membrana plasmática, como en las membranas internas y es la GTPasa implicada en el control del crecimiento celular polarizado. Como todas las GTPasas de la familia Rho, la señalización de Cdc42 está regulada por proteínas activadoras denominadas GEFs (del inglés “Guanine nucleotide Exchange Factors”) e inhibidoras denominadas GAPs (“GTPases Activating Proteins”). En la levadura de fisión, el control espacial de la activación de Cdc42 determina su morfología celular. Los GEFs, Scd1 y GEF1, se localizan en las zonas de crecimiento, polos y septo, donde Cdc42 está activa y la única proteína GAP descrita hasta la fecha, Rga4, se localiza en la membrana lateral de la célula, en las zonas sin crecimiento, donde Cdc42 está inactiva. Scd1 y Rga4 tienen papeles aditivos controlando la morfología celular. Gef1 por su parte, parece estar más implicado en los procesos de citocinesis y en la transición del crecimiento monopolar a bipolar denominada NETO (New End Take Off). En los polos, la dinámica de activación de Cdc42 presenta un comportamiento oscilatorio. Cdc42 controla el crecimiento celular polarizado mediante su proteína efectora For3. Esta formina promueve la formación de cables de actina en interfase, implicados, junto con las miosinas de clase V, en el movimiento de las vesículas secretoras, que contienen el nuevo material sintetizado, hacia las zonas de crecimiento activo. Además existe relación entre Cdc42 y el complejo proteico denominado exocisto, implicado en la fusión de las vesículas procedentes del Aparato de Golgi con la membrana plasmática. Aunque hasta la fecha no está claro como Cdc42 regula el exocisto, sí se sabe que la secreción polarizada llevada a cabo por For3 y el correcto funcionamiento del exocisto, son 2 procesos fundamentales para la correcta morfología de la célula. En este trabajo se ha estudiado el papel que desempeña la proteína GAP Rga6 en el control de la morfología celular de S. pombe y su relación con la GTPasa Cdc42. La deleción del gen rga6+ da lugar a células viables, por lo que no es un gen esencial. Sin embargo, Rga6 participa controlando las dimensiones celulares de S.pombe. En ausencia del gen rga6+ las células son ligeramente más cortas y más anchas que las células silvestres. La sobreexpresión de rga6+ también altera la morfología celular. A tiempos cortos, da lugar a células que se alargan y se estrechan por el único polo de crecimiento. La sobreexpresión de rga6+ a tiempos largos da lugar a células ensanchadas y ramificadas (10%). El fenotipo de deleción y sobreexpresión de rga6+ a tiempos cortos son similares a los observados para la proteína Rga4, GAP de Cdc42. La deleción conjunta de ambas GAPs da lugar a un fenotipo aditivo, en el que las células aunque polarizadas, muestran una morfología redondeada. En la cepa mutante rga4∆rga6∆, la GTPasa Cdc42 activa, normalmente localizada en los polos y el septo, se extiende por la membrana plasmática. Lo mismo sucede con For3, la proteína efectora de Cdc42. Sin embargo, otras proteínas, como Tea1, marcadora de los polos celulares, permanecen correctamente localizadas en ausencia de ambas GAPs, Rga4 y Rga6. Mediante el ensayo del doble híbrido en el laboratorio hemos determinado que Rga6 interacciona con las formas constitutivamente activas de las GTPasas Cdc42 y Rho2, otra GTPasa implicada en la biosíntesis de la pared celular y en la ruta MAPK de integridad celular. Para descartar que el papel de Rga6 en el control de la morfología fuese debido a su función como GAP de Rho2, se construyó la cepa mutante rho2∆rga4∆rga6∆, comprobando que presenta un fenotipo similar al del doble mutante rga4∆rga6∆. Posteriormente, se confirmó que Rga6 es GAP de Cdc42 mediante un ensayo de pull-down en extractos celulares. Se utilizó la sonda GST-CRIB (Cdc42/Rac Interactive Binding) derivada de la proteína PAK2 que se une a Cdc42 activa. Se observó que los niveles de Cdc42 activa aumentan en ausencia del gen rga6+ y disminuyen cuando la proteína GAP está sobreproducida. Además, la sobreexpresión de rga6+ con una mutación en la arginina catalítica del dominio GAP no da lugar al fenotipo observado cuando se sobreexpresa rga6+ silvestre, confirmando que la actividad GAP es necesaria para el control de la morfología celular. Rga6 se localiza en la membrana plasmática formando nodos discretos y su concentración disminuye en los polos de crecimiento. La visualización simultánea de Rga4-RFP y Rga6-GFP nos permitió observar que ambas GAP se localizan en los laterales de la célula pero no en los mismos nodos. Además, Rga6 y Rga4 no dependen una de la otra para su localización. Rga6 tampoco depende del citoesqueleto de microtúbulos o de actina para su localización en la membrana plasmática. Sin embargo, cuando se despolimeriza el citoesqueleto de actina, Rga6 deja de excluirse de los polos de crecimiento y se localiza homogéneamente por toda la membrana. Esto mismo ocurre en las células for3∆ que no tienen cables de actina. Sin embargo, en mutantes con los que los parches de actina alterados, Rga6 se localiza correctamente, por tanto su exclusión de los polos no depende de endocitosis. Mediante análisis de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) hemos visto que Rga6 presenta un comportamiento muy dinámico que parece ocurrir mediante difusión lateral en la membrana plasmática. En los polos de crecimiento hay un recambio más activo de Rga6 reflejado en un mayor porcentaje de recuperación de la fluorescencia máxima. En los laterales de la célula y en los polos sin crecimiento el recambio de Rga6 es menor. Cuando se despolimeriza la actina, Rga6 presenta una dinámica similar de recambio en los polos de crecimiento y en el resto de la membrana celular. Rga6 tiene 733aa y contiene en su estructura un dominio rico en Ser (187-253aa), un dominio GAP (329-547aa) y una región polibásica en su extremo C-terminal (700-733aa). Hemos estudiado el papel de los distintos dominios de la proteína Rga6 en su función y localización. Truncamientos de la proteína han puesto de manifiesto que el extremo N-terminal de Rga6 que contiene el dominio de Ser, (1-260aa) es necesario para la disminución de Rga6 en los polos de crecimiento ya que en su ausencia Rga6 se extiende homogéneamente por toda la membrana. Además, la proteína truncada ∆Nter de Rga6 no revierte totalmente el fenotipo de deleción de rga6+ observado en la cepa doble mutante rga4∆rga6∆, lo que indica que Rga6 sin su extremo N-terminal es parcialmente funcional. Por otro lado, en ausencia de los 33 últimos aa que constituyen la región polibásica de Rga6, la proteína pierde su localización en la membrana. Rga6 en el citoplasma no es capaz de revertir los defectos de la deleción de rga6+ en la cepa doble mutante rga4∆rga6∆, indicando que Rga6 para ser funcional tiene que estar en la membrana plasmática. La fusión de la región polibásica de Rga6 con GFP nos ha permitido concluir que esta parte de la proteína es suficiente para su localización en la membrana. El estudio de la relación de Rga6 con los GEFs de Cdc42, Scd1 y Gef1, parece indicar que, a diferencia de Rga4, Rga6 podría depender de Scd1 para controlar la morfología celular, puesto que la deleción simultánea de rga6+ y de scd1+ tiene el fenotipo de las células scd1∆. Scd2 es una proteína adaptadora de Scd1 y ambas son mutuamente dependientes. Scd2, se localiza correctamente en ausencia de rga6+. Por el contrario, en las células scd1∆, Rga6 se localiza homogéneamente por toda la membrana plasmática. Por otro lado, hemos visto que la sobreexpresión de rga6+ en la cepa mutante scd1∆ da lugar a células completamente redondas, en las que la proteína GAP se localiza uniformemente por toda la membrana plasmática. Rga6 podría participar en la regulación de los niveles de Cdc42 activa en los polos. En ausencia del gen rga6+ las oscilaciones de Cdc42 activa entre ambos polos se siguen produciendo y su periodo no varía, sin embargo, disminuye la amplitud de la oscilación, respecto a la observada en una cepa silvestre. Esto podría ser debido a un defecto en la regulación negativa de Cdc42. La inactivación de Cdc42 es necesaria para que se inicie el crecimiento bipolar. El papel de Rga6 en este proceso sería bastante sutil ya que la falta de Rga6 no se traduce en un defecto drástico en NETO, el porcentaje de células monopolares en la cepa mutante rga6∆ (38.4%), es sólo ligeramente mayor al observado en una cepa silvestre (32.2%). Sin embargo, las células rga6∆ presentan un menor crecimiento del polo nuevo, respecto al observado en una cepa silvestre, lo que podría estar relacionado con una menor inactivación de Cdc42 activo en el polo viejo. También hemos estudiado la relación de Rga6 y Rga4 con la proteína For3, efectora de Cdc42. Para ello se construyeron las cepas mutantes dobles rga6∆for3∆ y rga4∆for3∆, observando una interacción genética entre Rga6 y For3, mayor a la observada entre Rga4 y For3. Sin embargo, No hemos encontrado evidencias para poder concluir que este resultado se deba a un papel diferencial entre Rga6 y Rga4 controlando la función de Cdc42 en relación al complejo del exocisto. En resumen, nuestros resultados indican que Rga6 es una nueva GAP de Cdc42, que regula junto con Rga4 las dimensiones celulares de S. pombe. Rga6 se localiza en la membrana plasmática y se excluye de manera dinámica y transitoria de los polos de crecimiento. La localización de Rga6 en la membrana depende de una región polibásica situada en su extremo C-terminal. La disminución de Rga6 en las zonas de crecimiento depende de su extremo N-terminal y del citoesqueleto de actina. En los laterales de la célula, donde Rga4 y Rga6 se localizan, no están presentes en los mismos nodos. Además ambas GAPs no son mutuamente dependientes para su correcta localización. A diferencia de Rga4, Rga6 podría controlar la morfología celular de manera dependiente de Scd1. Finalmente, nuestros datos sugieren que Rga6 participaría en la regulación fina y precisa de los niveles de Cdc42 activa en los polos.