Medida de relaciones isotópicas y elementales mediante icp-qqqaplicaciones analíticas

Resumen

Desde su aparición en los años 80, la técnica ICP-MS se ha establecido como la herramienta analítica más poderosa para la detección elemental. Sin embargo, su aplicación a elementos de interés biológico como el S, P o Se entre otros, ha estado bastante limitada debido a sus altos potenciales de ionización y, sobre todo, a las severas interferencias poliatómicas a las que están sometidos. La reciente introducción de la configuración en tándem (MS/MS) en los equipos ICP-MS cambió drásticamente la situación. Un primer cuadrupolo previo a la celda colisión/reacción permite controlar los iones que entran en ella y, por tanto, eliminar las interferencias espectrales de forma más efectiva. Dicha configuración implica también una mejora en la relación señal-ruido, lo que conduce a mejores límites de detección, sobre todo para los elementos interferidos comentados anteriormente. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue el desarrollo de metodologías analíticas basadas en ICP-QQQ para la medida de relaciones isotópicas y elementales. Este objetivo general se acometió a través de los siguientes apartados: 1- Desarrollo de una metodología analítica genérica para la cuantificación absoluta de (fosfo)péptidos sin patrones específicos basada en ICP-QQQ. Se evaluó la metodología basada en el acoplamiento de LC capilar (capLC) al ICP-QQQ mediante una interfase de consumo total para la cuantificación absoluta de (fosfo)péptidos, a través de la determinación elemental de los heteroátomos presentes en ellos (P y S). La adición de patrones genéricos que contengan dichos heteroátomos a la muestra permite obtener factores de respuesta para cada elemento, que se aplican posteriormente para cuantificar el péptido analito. Los LD obtenidos para el análisis de (fosfo)péptidos por ICP-MS fueron los mejores hasta la fecha. 2- Desarrollo de una metodología para la cuantificación absoluta de proteínas sin patrones específicos mediante dilución isotópica post-columna. La posterior aplicación del capLC-ICP-QQQ a la cuantificación genérica de mezclas de proteínas requería encontrar condiciones que permitieran una recuperación cuantitativa de la columna cromatográfica empleada independientemente de la proteína, y la corrección de los cambios de sensibilidad que ocurren durante el gradiente. Una vez optimizadas tanto la cromatografía como la dilución isotópica post-columna, se validó la metodología con diferentes proteínas patrón obteniéndose LD en el rango de los fmol. Finalmente, se aplicó a la cuantificación absoluta genérica de las todas las proteínas (27) presentes en una muestra real de veneno de serpiente. El análisis paralelo por capLC-ESI-QTOF permitió convertir los fmol de S cuantificados en cada pico cromatográfico en fmol de la proteína correspondiente. 3- Desarrollo de una metodología para la determinación del grado de fosforilación global y específico en fosfoproteínas mediante relaciones P/S. El método desarrollado para la medida de P y S en péptidos, se aplicó para la determinación del grado global de fosforilación en fosfoproteína intacta. En cambio, el grado de los sitios específicos de fosforilación se determinó a través del análisis de sus péptidos trípticos. Finalmente, se evaluó la aplicabilidad del método en el análisis de una fosfoproteína sintética desarrollada en el laboratorio de Fisiología Celular y Molecular de Yale University. 4- Desarrollo de una metodología para la determinación de relaciones B/Ca a baja concentración en carbonatos de origen biogénico. Las interferencias isobáricas sobre los isótopos Ca y B en esta matriz junto a los problemas de blancos, han limitado hasta la fecha tanto la precisión como la exactitud en la determinación de dicha relación elemental de gran interés geológico. La optimización de las condiciones del ICP-QQQ junto con el sistema de introducción de muestra adecuado, permitieron desarrollar una metodología para medida precisa y exacta de la relación B/Ca, y con bajos límites de detección en dichas matrices.