Papel de NPL3, NUP84 y otros factores de transporte del MRNA en el mantenimiento de la integridad del genoma

Resum

El metabolismo del DNA agrupa diversos procesos, tales como la replicación, la transcripción y la reparación. Dado que éstos usan la misma molécula como molde, se requiere una coordinación precisa entre ellos para impedir la interferencia entre los mismos y garantizar la estabilidad del genoma (Aguilera y Garcia-Muse, 2013). Se sabe que la transcripción incrementa la recombinación entre secuencias de DNA, un fenómeno conocido como recombinación asociada a transcripción (TAR) (Gaillard et al., 2013). Este fenómeno es debido en parte a cambios topológicos durante la transcripción, que pueden dar lugar a una acumulación de DNA de cadena sencilla detrás de la RNA polimerasa (RNAP), así como a colisiones entre las maquinarias de transcripción y replicación (Bermejo et al., 2012). En células eucariotas, un proceso clave para evitar TAR es la biogénesis y transporte co-transcripcional de las partículas ribonucleoproteicas mensajeras (mRNPs), compuestas por el mRNA naciente unido a proteínas de unión a RNA (RBPs) (Luna et al., 2008). Se ha postulado que estas RBPs evitan la hibridación del mRNA con la cadena molde de DNA (híbridos de DNA-RNA), como es el caso del complejo THO, y que favorecen su procesamiento y transporte al citoplasma a través del complejo del poro nuclear (NPC) (Aguilera y Garcia-Muse, 2012). En esta tesis, hemos estudiado el papel de varios factores de transporte del mRNA en el mantenimiento de la integridad del genoma en la levadura Saccharomyces cerevisiae, incluidos la proteína Npl3, el complejo THSC/TREX-2 asociado al NPC y el sub-complejo Nup84 del NPC. En esta tesis se ha observado que las células carentes de Npl3, una RBP con funciones en transcripción, procesamiento y transporte el mRNA (Lei et al., 2001; Dermody et al., 2008; Kress et al., 2008), requieren la recombinación para sobrevivir al daño en el DNA y muestran un defecto suave en la reparación de roturas de doble cadena por unión de extremos no homólogos, lo cual sugiere un papel de Npl3 en la reparación del DNA. Estas células sufren inestabilidad genómica asociada a transcripción, la cual se debe en parte a la formación de híbridos de DNA-RNA, y sus fenotipos se suprimen por la sobreexpresión de otras RBPs, acorde con una función de Npl3 en la biogénesis y transporte de las mRNPs. Npl3 se une a regiones transcritas a lo largo de todo el genoma, preferentemente a genes con altos niveles de transcripción por RNAPII. Esta unión sigue una distribución que se incrementa hacia el extremo 3¿ de los genes, lo cual estaría de acuerdo con un reclutamiento durante la elongación de la transcripción. Por otro lado, la deleción de Npl3 provoca una caída en los niveles de expresión de genes altamente transcritos y un defecto de replicación a lo largo de todo el genoma, detectado por una acumulación preferente de la helicasa replicativa Rrm3 en esta clase de genes. Dicha acumulación es dependiente de híbridos de DNA-RNA. Estos resultados sugieren que Npl3 protege la integridad del genoma impidiendo la formación de dichas estructuras. Hemos ampliado y extendido el análisis genómico al complejo THSC/TREX-2, que también participa en la transcripción y el transporte del mRNA, y también protege a las células de la inestabilidad genómica mediada por RNA (Gallardo et al., 2003; Rodriguez-Navarro et al., 2004; Gonzalez-Aguilera et al., 2008). Hemos observado que la ausencia de dos subunidades representativas, Thp1 y Sac3, de THSC/TREX-2 genera perfiles de transcripción similares entre sí y que a su vez son distintos a los de mutantes del complejo THO y de la subunidad Sus1. Thp1 y Sac3 se unen a los genes a lo largo de todo el genoma siguiendo distribuciones idénticas, de acuerdo con su papel en la célula como una unidad funcional y estructural. Se acumulan preferentemente en genes de alta expresión siguiendo un gradiente de ocupación que se incrementa hacia su extremo 3¿. Las células carentes de Sac3 también muestran un fuerte defecto de replicación, detectado por un enriquecimiento de Rrm3 en genes altamente transcritos. Estos datos apoyan la idea de que THSC/TREX-2 es necesario para la evitar las colisiones entre la transcripción y la replicación que provocan inestabilidad genómica. Finalmente, hemos explorado el papel del sub-complejo Nup84 del NPC en el mantenimiento de la integridad del genoma (Bukata et al., 2013). Hemos comprobado que las células carentes de componentes de Nup84 o de la nucleoporina de la ¿cesta nuclear¿ Nup60 requieren la recombinación para su supervivencia, lo que indica una acumulación de daño en el DNA. A pesar del papel previamente descrito de Nup84 en la elongación de la transcripción (Tous et al., 2011), las células nup84¿ presentan inestabilidad genómica independiente de transcripción. Estas células son defectuosas en reparación de roturas dependientes de replicación mediante recombinación con la cromátida hermana, y muestran un retraso en la progresión de las horquillas de replicación. Los datos sugieren por tanto que Nup84 es necesaria para la reparación del daño en el DNA generado durante la replicación. En conjunto, los resultados de esta tesis apoyan el modelo actual de que los factores de biogénesis y transporte de las mRNPs son claves para evitar la inestabilidad del genoma asociada a conflictos entre la transcripción y la replicación, aportando una perspectiva genómica a un problema fundamental en Biología. Igualmente, este trabajo sugiere nuevas conexiones entre los factores de transporte del mRNA y la reparación del DNA que deberán ser explorados en el futuro. REFERENCIAS Aguilera A, Garcia-Muse T. 2012. R loops: from transcription byproducts to threats to genome stability. Mol Cell 46: 115-24. Aguilera A, Garcia-Muse T. 2013. Causes of Genome Instability. Annu Rev Genet. Bermejo R, Lai MS, Foiani M. 2012. Preventing replication stress to maintain genome stability: resolving conflicts between replication and transcription. Mol Cell 45: 710-8. Bukata L, Parker SL, D'Angelo MA. 2013. Nuclear pore complexes in the maintenance of genome integrity. Curr Opin Cell Biol 25: 378-86. Dermody JL, Dreyfuss JM, Villen J, Ogundipe B, Gygi SP, Park PJ, Ponticelli AS, Moore CL, Buratowski S, Bucheli ME. 2008. Unphosphorylated SR-like protein Npl3 stimulates RNA polymerase II elongation. PloS One 3: e3273. Gaillard H, Herrera-Moyano E, Aguilera A. 2013. Transcription-associated genome instability. Chem Rev 113: 8638-61. Gallardo M, Luna R, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Aguilera A. 2003. Nab2p and the Thp1p-Sac3p complex functionally interact at the interface between transcription and mRNA metabolism. J Biol Chem 278: 24225-32. Gonzalez-Aguilera C, Tous C, Gomez-Gonzalez B, Huertas P, Luna R, Aguilera A. 2008. The THP1-SAC3-SUS1-CDC31 complex works in transcription elongation-mRNA export preventing RNA-mediated genome instability. Mol Biol Cell 19: 4310-8. Kress TL, Krogan NJ, Guthrie C. 2008. A single SR-like protein, Npl3, promotes pre-mRNA splicing in budding yeast. Mol Cell 32: 727-34. Lei EP, Krebber H, Silver PA. 2001. 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