Participación del calcio en la ruta de señalización asociada a la deficiencia de boro en las raíces de "Arabidopsis thaliana"

Resumen

1) INTRODUCCIÓN El boro (B) es un nutriente esencial para las plantas vasculares y tanto su deficiencia como su toxicidad afectan a numerosos procesos metabólicos y fisiológicos (Nable y col., 1997; Blevins y Lukaszewski, 1998; Bolaños y col., 2004; Reid, 2007; Camacho-Cristóbal y col., 2008; Herrera-Rodríguez y col., 2010; Martín-Rejano y col., 2011). El B, en forma de ácido bórico o borato, es capaz de formar complejos con una gran variedad de compuestos biológicos que contienen dos grupos hidroxilo en configuración cis. Una de las principales funciones del B en las plantas vasculares está relacionada con la pared celular, ya que se establecen enlaces éster entre el anión borato y los residuos de apiosa del ramnogalacturonano II (RGII); la construcción de este complejo es fundamental para la estructura y función de la pared celular (O¿Neill y col., 2004), y desempeña una función crítica en los tejidos en crecimiento. Entre el 80 y el 90% del B total presente en la planta se encuentra en las paredes celulares formando dímeros de RGII, siendo este complejo esencial para la estructura y función de la pared celular; por lo tanto, se puede decir que la principal función de este micronutriente es estructural (Blevins y Lukaszewski, 1998). La deficiencia en B no sólo tiene efectos sobre la estructura y función de la pared celular de las plantas vasculares sino que, además, influye sobre otros muchos procesos: metabolismo del ácido indolacético, translocación de azúcares, metabolismo de carbohidratos, síntesis de ácidos nucleicos, crecimiento del tubo polínico, potencial de membrana, enzimas del plasmalema, flujo de iones a través de las membranas, proteínas del citoesqueleto (Blevins y Lukaszewski, 1998; Bolaños y col., 2004; Goldbach y Wimmer, 2007), acumulación de compuestos fenólicos y poliaminas (Camacho-Cristóbal y col., 2002, 2004 y 2005), asimilación de nitrógeno (Camacho-Cristóbal y González-Fontes, 2007; Beato y col., 2010, 2011 y 2014), y desarrollo de la raíz (Martín-Rejano y col., 2011), entre otros. Aunque se desconoce el mecanismo molecular por el cual la planta es capaz de sentir la deficiencia de este micronutriente y desarrollar la respuesta fisiológica, recientemente se ha propuesto que el calcio podría estar directamente implicado en la transmisión de esta señal. Se conocen múltiples estreses bióticos y abióticos que afectan a la concentración de calcio citosólico, provocando ¿firmas de calcio¿ (Sanders y col., 2002; Hetherington y Brownlee, 2004), es decir, patrones espacio-temporales de cambio en los niveles de calcio que son específicos para cada estímulo. Estas ¿firmas de calcio¿ se deben a movimientos de calcio regulados mediante canales y bombas (Sanders y col., 2002; Hetherington y Brownlee, 2004; Bastistic y Kudla, 2012); posteriormente son percibidas, descodificadas y transmitidas mediante proteínas de unión a calcio, como: calmodulinas, proteínas similares a calmodulinas, quinasas dependientes de calcio y proteínas similares a calcineurina-B (Sanders y col., 2002; Hashimoto y Kudla, 2011). Cuando estas proteínas se unen al calcio, se activan interaccionando a su vez con otras proteínas; de esta manera, la información contenida en la ¿firma de calcio¿ es transmitida a través de eventos de fosforilación, cambios en las interacciones entre proteínas o mediante regulación transcripcional y, por lo tanto, induciendo las respuestas ante cada estrés. Se piensa que algunos de estos sensores de calcio podrían estar involucrados en la señal de deficiencia de B. 2) OBJETIVOS A pesar de que la deficiencia de B provoca múltiples efectos en la fisiología y bioquímica de las plantas vasculares, se desconoce el mecanismo a través del cual las plantas son capaces de sentir y transmitir esta señal. Recientemente se ha propuesto que el calcio (Ca2+) podría mediar en este proceso de señalización. Por tanto, los objetivos de esta investigación fueron determinar si hay una relación entre la deficiencia de B y la concentración de calcio citosólico ([Ca2+]cit), y si el Ca2+ participa en la transmisión de la señal de deficiencia de B en las raíces de Arabidopsis thaliana; también fue interesante determinar qué genes/proteínas participarían en esta señalización, así como estudiar la interacción con otros cationes, como el potasio. 3) METODOLOGÍA En un primer momento se estudió si la deficiencia de B a corto plazo afectaba a los niveles de expresión de genes relacionados con la señalización de calcio en las raíces de Arabidopsis. Con este fin, se cultivaron plántulas de la estirpe silvestre Col0 y se transfirieron a medios con suficiencia o deficiencia de B durante 6 y 24 horas, se tomaron muestras de raíces de las cuales se hizo una extracción de RNA y una posterior síntesis de cDNA para analizar los niveles de expresión mediante Q-RT-PCR. También se estudió el efecto de la adición al medio de reactivos que alteraran la disponibilidad de calcio para las plántulas, con el objetivo de determinar si había cambios en el patrón de expresión de los genes analizados. Posteriormente se analizó la actividad GUS bajo el control de varios promotores (pCML12::GUS, pCML24::GUS, pCPK28::GUS, pACA10::GUS y pMYB15::GUS) en raíces de plántulas de Arabidopsis que habían sido sometidas a deficiencia de B durante 6 y 24 horas, con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos previamente. Al igual que antes, se repitieron los experimentos añadiendo diferentes reactivos a los medios de cultivo. A continuación, se estudió si el efecto de la deficiencia de B a corto plazo afectaba únicamente a la expresión génica o si también lo hacía sobre los niveles de proteínas en las raíces de Arabidopsis. Para ello se realizaron diferentes WESTERN-BLOTS para las proteínas: CAX3, CNGC19 y ACA10, usando para ello anticuerpos específicos contra cada una de ellas. El siguiente paso fue determinar si la deficiencia de B a corto plazo afectaba realmente a los niveles de calcio en plántulas de Arabidopsis. Este estudio se llevó a cabo mediante microscopía de fluorescencia (epi-fluorescencia y confocal), para lo que se empleó una línea transgénica (cedida generosamente por el Prof. Dr. Jörg Kudla, Universidad de Münster) que expresaba de forma estable la construcción Yellow Cameleon 3.6 (YC3.6), un sensor que permite monitorizar los cambios en los niveles de calcio citosólico, a tiempo real, mediante el fenómeno de transferencia de energía FRET. Para ello se cultivaron las plántulas y se sometieron a deficiencia de B durante 6 y 24 horas. Con el objetivo de determinar el origen del cambio en el nivel de calcio, se analizó el efecto de la adición al medio de distintos reactivos, como agentes quelantes de calcio, inhibidores de transportadores de calcio, entre otros. Con el fin de intentar identificar cuáles eran los genes responsables del cambio en el nivel de calcio citosólico observado en las raíces de las plántulas de Arabidopsis sometidas a deficiencia de B, se realizaron cruces entre la línea transgénica que expresaba de forma estable la construcción YC3.6 con líneas knock-out insercionales para los siguientes genes: CBL1, CBL4, CBL5, CBL9, CAX3, CDPK28, CDPK29, WRKY46, CML24, ACA10, CNGC19, MYB15 y BZIP34; de esta forma se obtuvieron líneas homocigóticas insercionales que, al mismo tiempo, expresaban de forma estable la construcción YC3.6. Esto permitió estudiar cómo afectaba el silenciamiento de estos genes a los niveles de calcio citosólico en condiciones de deficiencia y suficiencia de B. Se cultivaron las plántulas y se sometieron a deficiencia de B durante 6 y 24 horas. Se investigó si la deficiencia de B podía afectar no sólo a los niveles de calcio citosólico, sino también a los de otros cationes en las raíces de Arabidopsis. Para ello se empleó el sistema de cromatografía iónica Dionex, con el que se cuantificó los niveles de calcio, litio, sodio, potasio y amonio, en condiciones de deficiencia y suficiencia de B, tanto en plántulas silvestres como en algunos de los mutantes obtenidos para los genes de interés en la investigación. 4) RESULTADOS El resultado del análisis de expresión génica mediante Q-RT-PCR mostró que varios genes que codifican transportadores (ACA y CAX) y canales de Ca2+ (CNGC) se sobreexpresaron en deficiencia de B, así como los genes de algunas proteínas similares a calmodulina (CML) y de quinasas (CPK) dependientes de calcio. Pero los genes IQD, que contienen motivos de unión a calcio, se reprimieron. Además, las expresiones de algunos factores de transcripción (MYB, WRKY y bZIP) se afectaron por deficiencia de B. También se estudió el efecto de la adición al medio de reactivos como el EGTA y el ácido abscísico (ABA), observándose cambios significativos sobre el patrón de expresión de estos genes y de otros en condiciones de suficiencia o deficiencia de B. Los resultados del análisis de expresión génica mediante tinción GUS indicaron que todos los genes analizados se sobreexpresaron como consecuencia de la ausencia de B en el medio, confirmando el efecto previamente observado mediante Q-RT-PCR. Al igual que antes, se emplearon reactivos como el EGTA y el ABA, obteniéndose cambios significativos sobre la expresión de estos genes. El análisis de los niveles de calcio mediante microscopía de fluorescencia mostró que las plántulas que procedían de un medio con deficiencia de B tenían unos niveles de calcio significativamente más altos que aquéllas que procedían de un medio con suficiencia tras 6 y 24 horas de tratamiento. Con el objetivo de determinar si el incremento de calcio se debió a una liberación del almacenado en los reservorios internos de las células, o bien a una entrada de calcio extracelular, se analizó el efecto de la adición al medio de distintos reactivos, como agentes quelantes de calcio, inhibidores de transportadores de calcio, y otros. Los resultados indicaron que los niveles de calcio citosólico se veían afectados de forma diferente en función de la presencia o ausencia de determinados compuestos en el medio, en condiciones de deficiencia o suficiencia de B. Además, el estudio de los mutantes a los que se les había insertado la construcción YC3.6 mostró cambios en los niveles de calcio en condiciones de suficiencia y deficiencia de B, en función del gen que había sido interrumpido. Finalmente, el estudio del efecto de la deficiencia de B sobre los niveles de otros cationes mostró diferencias significativas en las concentraciones de algunos de estos, por lo que la deficiencia de este micronutriente no sólo afecta a los niveles de calcio. Tomando estos resultados en conjunto, se puede proponer el siguiente mecanismo por el cual las raíces de Arabidopsis responden a la deficiencia de B. En primer lugar esta deficiencia causaría un aumento en los niveles de nucleótidos cíclicos que activarían a CNGC19, lo que causaría un incremento temporal en los niveles de calcio, esta señal sería descodificada en el núcleo mediante interacciones con calmodulinas y factores de transcripción desencadenando la respuesta fisiológica. Posteriormente, los elevados niveles citosólicos de calmodulinas inhibirían la actividad de los CNGCs. Finalmente, los transportadores de calcio ACA10 y CAX3 reestablecerían la homeostasis de calcio. 5) BIBLIOGRAFÍA -Batistic O, Kudla J (2012). Analysis of calcium signaling pathways in plants, Biochim. Biophys. Acta e Gen. Subj. 1820: 1283-1293. -Beato VM, Rexach J, Navarro-Gochicoa MT, Camacho-Cristóbal JJ, Herrera-Rodríguez MB, Maldonado JM, González-Fontes A (2010). A tobacco asparagine synthetase gene responds to carbon and nitrogen status and its root expression is affected under boron stress. Plant Science 178: 289-298. -Beato VM, Teresa Navarro-Gochicoa M, Rexach J, Begoña Herrera-Rodríguez M, Camacho-Cristóbal JJ, Kempa S, Weckwerth W, González-Fontes A (2011). Expression of root glutamate dehydrogenase genes in tobacco plants subjected to boron deprivation. 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