Estudio del establecimiento de la polaridad epitelialbúsqueda de nuevas proteínas que interaccionan con aPKC

Resumen

Las células eucarióticas presentan una distribución asimétrica de moléculas y orgánulos que genera diferentes regiones funcionales necesarias para la fisiología celular. La maquinaría de tráfico vesicular tiene un papel esencial en la formación de esta polaridad celular, estando ambos procesos regulados mutuamente para llevar a cabo los cambios en la morfología celular necesarios durante el desarrollo de un organismo. Dentro de la maquinaría de la polaridad celular, destaca la Proteína Quinasa C atípica (aPKC), una de las pocas quinasas implicada en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular. aPKC participa en procesos como migración, división celular, supervivencia o proliferación; estando implicada además en diversos tipos de cáncer. La actividad de aPKC está regulada por interacción con otras proteínas que modifican su localización y/o regulan su actividad quinasa. Además, aPKC fosforila a multitud de substratos modificando su compartimiento. Estos interactores de aPKC son diferentes dependiendo del proceso celular, de modo que encontrar nuevas proteínas que interaccionen con aPKC resulta fundamental para entender mejor cómo funciona esta quinasa. En este trabajo he realizado una búsqueda bioquímica de nuevas proteínas que interaccionen con aPKC. Para ello he sobreexpresado en embriones de Drosophila la proteína aPKC fusionada a una serie de epítopos que me han permitido purificar complejos proteicos en condiciones nativas en los que aPKC participa. Usando esta metodología he aislado la proteína Nuclear fallout (Nuf) como un nuevo interactor de aPKC. Nuf es homólogo a Rab11-FIP3 de vertebrados y participa en el transporte de los endosomas de reciclaje (RE) a través de su interacción con Rab11 y las proteínas motoras Dineína y Kinesina. En esta tesis he demostrado que aPKC se une a Nuf directamente. Esta unión se produce entre la mitad N-terminal de Nuf y el dominio quinasa de aPKC, solo cuando aPKC está activa (autofosforilada). He identificado a Nuf como un nuevo substrato de aPKC. Dicha fosforilación se produce en la serina 155 y elimina la unión aPKC-Nuf, ya que la versión fosfomimética de Nuf (Nuf S155D) es incapaz de unirse a aPKC. En el disco imaginal de ala, cuyas células están altamente polarizadas en un eje apico-basal, he descubierto que la falta de función de aPKC produce una acumulación de Nuf y Rab11 en el córtex subapical, sugiriendo que aPKC afecta el tráfico de RE. Esto se debe al efecto de la fosforilación de aPKC en la localización subcelular de Nuf. La versión no fosforilable de Nuf (Nuf S155A) se acumula en la región subapical co-localizando con aPKC en la membrana plasmática, mientras que la versión fosfomimética Nuf S155D aparece en la región subapical pero evita el contacto con la membrana. También he observado que la sobreexpresión de Nuf S155A aumenta los niveles de aPKC en la membrana subapical, mientras que la falta de función de nuf produce una disminución aPKC en la membrana, lo que sugiere un transporte de aPKC vía Nuf. Esto lo he corroborado al eliminar la función de Sec5, Sec6 o Rab11, componentes de la ruta de reciclaje. En estas condiciones, aPKC se acumula intracelularmente y desaparece de las uniones celulares. Los resultados de este trabajo muestran la existencia de un reciclaje de aPKC en un tejido maduro, en el que aPKC es transportada hacia la membrana subapical vía Rab11-Nuf. Este reciclaje estaría regulado en una retroalimentación negativa por la propia aPKC, que fosforila a Nuf evitando su unión a la membrana.