Regulación por nitrógeno en pseudomonas putida

Resumen

El objetivo de este proyecto de tesis es estudiar la regulación por nitrógeno en la bacteria de suelo Pseudomonas putida, un organismo modelo en el estudio de la biodegradación de contaminantes orgánicos. Para ello, en una primera fase se ha hecho un estudio a nivel global, mediante el uso de microarrays de DNA, de la respuesta de P. putida a la disponibilidad de nitrógeno en el medio de cultivo y de cómo afecta la pérdida del gen NtrC, conocido regulador global de respuesta a nitrógeno en enterobacterias y presente también en el genoma de P. putida, a la expresión de genes en condiciones de limitación de nitrógeno. Los resultados de los microarrays han sido validados usando la técnica de PCR cuantitativa para medir la expresión de diversos genes. Una vez obtenida una visión general de la regulación por nitrógeno, pasamos en una segunda fase a estudiar la regulación por nitrógeno de genes de interés seleccionados del estudio por microarrays, para profundizar en los mecanismos moleculares de dicha regulación y determinar las similitudes y diferencias que existen entre esta regulación en enterobacterias y en P. putida. Así, se determinaron los inicios de la transcripción, el tipo de promotor que opera en cada gen seleccionado, y si dependen directamente del regulador global NtrC. Para ello se utilizaron diversas técnicas tales como ensayos de actividad B-galactosidasa, extensión desde cebador, ensayos de protección frente a digestión con DNasal, ensayos de formación de complejo abierto y ensayos de transcripción in vitro.