La fosfatasa mitocondrial PPTC7, punto de encuentro de la regulación del metabolismo bioenergético y la autofagia

Resumen

El coenzima Q (CoQ) es un componente esencial de la bioenergética y de la protección antioxidante de la célula. Esto se debe en parte a su estructura, formada por una cabeza polar y una cola poliisoprenoide, que le permite insertarse y moverse en las biomembranas. Y por otro lado a su capacidad rédox, ejerciendo un importante papel en el transporte de electrones en diversos sistemas, siendo la función más relevante la que acontece en la cadena respiratoria mitocondrial y en la regeneración de antioxidantes celulares. El creciente número de estudios de enfermedades que cursan con un déficit de coenzima Q10 han permitido incrementar el conocimiento sobre el papel del CoQ en la fisiología celular. La depleción de los niveles de coenzima Q se ha asociado, no sólo a una causa primaria por defectos en la biosíntesis del mismo, sino también a enfermedades neurodegenerativas y al envejecimiento. El mayor hándicap en el tratamiento de estas patologías se debe a la baja biodisponibilidad del coenzima Q. El CoQ es el único antioxidante lipídico sintetizado por la célula. Su carácter lipofílico, necesario para el ejercicio de sus funciones, se convierte en un inconveniente en las terapias basadas en la complementación en la dieta con coenzima Q, especialmente para el acceso a órganos como el cerebro a través de la barrera hematoencefálica, uno de los más dañados ante una deficiencia metabólica. Hasta ahora las estrategias de los tratamientos se enfocaban en la obtención de análogos con baja hidrofilicidad, aunque recientemente, y cada vez más, se hace patente la necesidad de terapias alternativas basadas en la estimulación de la síntesis endógena. Excepto en organismos unicelulares como bacterias y levaduras, la deficiencia total de coenzima Q no existe en la naturaleza, y tan solo deficiencias de un cierto porcentaje son relativamente viables. Por ello, una estimulación de la biosíntesis de CoQ10 en dichos pacientes podría restaurar o al menos paliar el fenotipo disfuncional. Sobre la biosíntesis de coenzima Q, numerosos estudios en Saccharomyces cerevisiae han establecido una serie de genes que codifican para proteínas implicadas en dicha ruta, los genes COQ (COQ1-COQ10). El conocimiento sobre esta ruta en mamíferos es muy limitado, aunque menos datos existen en la literatura sobre la regulación de la biosíntesis de coenzima Q. En levadura se han establecido diversos puntos de regulación en la ruta biosintética. Uno de ellos es Coq7p, una monooxigenasa implicada en catabolizar uno de los últimos pasos de la síntesis. La actividad de esta proteína está regulada en levadura por ciclos de fosforilación y defosforilación, activándose por la acción de dos fosfatasas, Ptc6p y Ptc7p. En el trabajo desarrollado en esta tesis doctoral se describe el primer mecanismo biomolecular a través del cual se regula la biosíntesis de coenzima Q10 en células humanas en cultivo de manera endógena. En una búsqueda de homólogos de las fosfatasas implicadas en la regulación de Coq7p, se encontraron tan sólo homólogos de Ptc7p en eucariotas superiores, quedando Ptc6p relegado al reino fungi. En humanos, éste corresponde a Pptc7, una presunta fosfatasa. Análisis in silico de la secuencia peptídica de esta proteína determina que pertenece a la familia de serinas/treoninas fosfatasas dependientes de metales, PP2C. Mediante una caracterización bioquímica, se determina la actividad de Pptc7 como proteína fosfatasa en ensayos in vitro. Para su actividad fosfatasa requiere los cofactores Mg+2 y Mn+2, los cuales son insustituibles por otros metales como Fe+2 o Fe+3. Esta dependencia de Mn+2 y Mg+2 es característica de la familia PP2C de fosfatasas monoméricas. Además, su actividad no se ve afectada por el inhibidor de fosfatasas genérico ortovanadato sódico, al igual que los otros miembros de la misma familia. Una de las mayores diferencias con otras familias de fosfatasas es la ausencia de subunidad reguladora. Por ello su regulación viene dada por modulación de su expresión y por la sublocalización celular. El complejo de biosíntesis de coenzima Q se localiza en la mitocondria, así como hCoq7. La secuencia peptídica de Pptc7 muestra, en ensayos in silico una potencial secuencia de importación mitocondrial. Mediante fraccionamiento se comprueba que efectivamente, Pptc7 se transloca a la mitocondria. El mutante ptc7 presenta una depleción de los niveles de coenzima Q6 y de sus actividades asociadas de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, así como un incremento del consumo de oxígeno in vivo en células enteras. Estos datos indican una disfunción mitocondrial causada por la deficiencia de CoQ6, la cual es revertida al complementar la estirpe mutante con el propio gen de levadura o con el heterólogo humano. Mediante complementación funcional se observa que el fenotipo del mutante para PTC7 en levadura se recupera al sobreexpresar PPTC7, confirmando la homología entre ambas fosfatasas. En ensayos in vitro se describe a la proteína humana hCoq7 como una fosfoproteína, la cual es capaz de ser defosforilada por Pptc7. La manipulación de la expresión de PPTC7 en células humanas en cultivo produce una modulación de los niveles de coenzima Q10. La sobreexpresión de PPTC7 transitoria duplica los niveles de CoQ10 de una línea control, mientras que su silenciamiento produce, en 48 horas, una depleción del 50%. Este silenciamiento afecta al estado de la célula de tal modo que el establecimiento de una línea estable silenciada es inviable. En moscas el silenciamiento de PPTC7 produce un defecto en el desarrollo y una consecuente parada en los primeros estadíos de la pupa, además de una deficiencia del contenido quinónico. En el caso de levadura, mientras que el mutante simple ptc7 o ptc6 resultan viables, el doble mutante es letal. Aunque los niveles de coenzima Q10 se incrementan, la velocidad de síntesis se encuentra disminuida en las células que sobreexpresan PPTC7. En la levadura mutante ptc7 se observa un incremento de la incorporación del precursor pHB radiomarcado con [14C] con respecto al silvestre. Este efecto se ha observado en otros estudios del grupo sobre deficiencias secundarias de coenzima Q. En pacientes con deficiencias primarias de CoQ10, el complejo de biosíntesis del mismo presenta un defecto, y la velocidad de síntesis de coenzima Q10 es menor en comparación con células provenientes de individuos sanos. En una deficiencia secundaria, las diversas proteínas que componen la ruta de síntesis de coenzima Q se encuentran intactas, siendo capaces de realizar el proceso correctamente. En este caso, los bajos niveles de CoQ, obtenidos a causa de un defecto en un punto fuera de la propia ruta de síntesis, pueden estimular la actividad del complejo de biosíntesis con el fin de paliar la deficiencia. Por ello no es de extrañar que la incorporación de pHB se encuentre incrementada en estos casos. A pesar de presentar un incremento de los niveles de CoQ10 en células que sobreexpresan PPTC7, las actividades de la cadena no se ven afectadas, aunque sí presentan un incremento del consumo de oxígeno por respiración. Estos datos, junto con una menor producción de ROS, tanto a nivel celular como mitocondrial, sugieren un mejor acoplamiento de la fosforilación oxidativa y una actividad de la cadena transportadora de electrones mitocondrial más eficiente. Un reciclaje competente de la masa mitocondrial elimina aquellos orgánulos dañados y potencialmente dañinos para la célula, obteniendo una menor liberación de ROS provenientes del mal funcionamiento de la cadena transportadora de electrones. Estudios recientes relacionan diferentes patologías asociadas a deficiencias de coenzima Q10 con procesos de mitofagia como sistema de defensa ante el daño generado por mitocondrias disfuncionales, ante la necesidad de un reciclaje de las mismas. En levadura, Ptc6 está implicado en dos procesos íntimamente relacionados, la biosíntesis de coenzima Q6 y la degradación selectiva de mitocondrias ante un cambio en la fuente de carbono. De tal manera, en la adaptación a fuentes de carbono no fermentables y ante la necesidad de activar el metabolismo respiratorio, dispara la biosíntesis de CoQ6. Ante una situación contraria de adaptación al metabolismo fermentativo, activa la mitofagia para la eliminación de la masa mitocondrial residual. En células de mamífero la mitofagia, a excepción de la ejercida en la diferenciación de los eritrocitos, se compone de un nivel basal para el mantenimiento de la homeostasis celular, y de una degradación selectiva de aquellas mitocondrias disfuncionales que presentan una pérdida del potencial mitocondrial e incremento en la producción de ROS. En levadura Ptc7p responde, a diferencia que Ptc6p, a estímulos de estrés. Un estrés leve posee un efecto hormético en la célula, generando una respuesta antioxidante. Este es el caso de la restricción calórica y de compuestos ampliamente estudiados como el resveratrol. Sin embargo, un estrés oxidativo más fuerte puede generar graves daños en las estructuras celulares y finalmente muerte por apoptosis. La cadena transportadora de electrones mitocondrial es uno de los mayores productores de ROS en la célula. Una degradación selectiva de las mitocondrias dañadas es esencial para el mantenimiento celular. Líneas estables para la sobreexpresión de PPTC7 presentan un incremento de los procesos degradativos celulares, incluyendo la degradación de proteínas mitocondriales, ante una retirada de suero. La monitorización de la autofagia en los mutantes ptc6 y ptc7 de levadura revela un papel esencial de ambas en el proceso de degradación selectivo de mitocondrias, pero no en la macroautofagia ante la deprivación de nitrógeno. Por otro lado, la sobreexpresión de las fosfatasas Ptc7 y Pptc7 en levadura silvestre produce un incremento de la mitofagia en fase estacionaria. Los mecanismos a través de los cuales Pptc7 regula la actividad autofágica de mitocondrias continúan siendo desconocidos. Las pautas de expresión de PPTC7 se corresponden tanto a situaciones de incremento de coenzima Q como situaciones de disparo de la autofagia, incrementando los niveles de ARNm ante diversas situaciones de estrés. Ante un insulto con un estrés leve, la célula activa los mecanismos de defensa antioxidante, incrementando, entre otros, los niveles de coenzima Q. Para ello es necesaria una activación de la regulación del complejo de biosíntesis, modulada por la acción de Pptc7 sobre hCoq7. Cuando el daño producido no puede solventarse, es necesaria la activación de mecanismos de reciclaje con el fin de atenuar el efecto oxidativo, especialmente al tratarse de la mitocondrias. Un daño en este orgánulo puede producir un incremento de la producción de ROS, acentuando el trastorno producido. Ante esta situación, Pptc7 podría activar la mitofagia selectiva, manteniendo así la calidad del contenido celular. La restricción calórica se ha considerado ampliamente en la literatura por los efectos beneficiosos que supone un estrés moderado para la homeostasis celular. En estas situaciones de estrés moderado, los mecanismos de respuesta antioxidante se encuentran regulados positivamente, como es el caso del coenzima Q. En una línea de células HeLa adaptadas a crecer en medio con menos del 25% de glucosa (RC) que la línea original, se sintetiza del orden de dos veces más coenzima Q10, al igual que ocurre al sobreexpresar PPTC7. La expresión de este gen se encuentra regulada positivamente en esta línea RC, mientras que la expresión de COQ7 no se afecta, apuntando a una regulación post-traduccional de su actividad. En una caracterización de esta línea se observa que los niveles de CoQ10 no afectan las actividades de la cadena respiratoria pero sí produce una fosforilación oxidativa mejor acoplada, disminuyendo considerablemente la generación de ROS. Por tanto, en un sistema in vivo sin manipulación génica, ante una situación de estrés moderado, la expresión de PPTC7 se regula positivamente, estimulando la síntesis de coenzima Q10 del mismo modo que al generar líneas de sobreexpresión del mismo, y las mitocondrias funcionan de una manera más eficiente y funcional. Diversos estudios han determinado el disparo de la autofagia en condiciones de restricción calórica y el efecto beneficioso que éste acarrea. Recientes estudios describen regulaciones por ciclos de fosforilación y defosforilación de las proteínas implicadas en la mitofagia. La proteína quinasa activada por AMP (AMPK) es un sensor intracelular de la disponibilidad de nutrientes y de estrés. Esta quinasa fosforila a Ulk1, ortólogo en mamífero de la proteína quinasa de levadura Atg1, implicada en la iniciación de la autofagia y requerido para el proceso especifico de degradación de mitocondrias. Esta fosforilación es requerida para una correcta mitofagia. La inducción de la expresión de PTC7 en levadura ante un estrés osmótico depende de Hog1p, una de las dos MAPKs descritas en el proceso de fosforilación de Atg1p en levadura. Por otro lado, la proteína de levadura Atg32, considerada un receptor mitocondrial de la mitofagia, presenta dos serinas fosforiladas requeridas para su interacción con Atg11 y para la mitofagia. Sin embargo, la sustitución de dichas serinas por ácido aspártico o glutámico para mimetizar la fosforilación no resultan funcionales para la mitofagia. Esto hace suponer que Atg32p no sólo requiere de la fosforilación, sino también de una eliminación de los grupos fosfatos mediante una fosfatasa, lo cual no es posible en el caso de la mimetización del estado fosforilado por sustitución de los aminoácidos serinas. La proteína Atg1 presenta una relación sintética con la fosfatasa Ptc6p, aunque en mamíferos tan sólo existen ortólogos de Atg1p y no de dicha fosfatasa. Ambas proteínas, Ulk1 y Nix (proteína de mamífero sobre la cual se ha sugerido ser homólogo de Atg32p), podrían ser presuntas dianas de Pptc7 en el disparo de la mitofagia. En la literatura se ha asociado PPTC7 con mecanismos de supervivencia y actividad antitumoral. Además, un estudio reciente sobre una población con una mutación en la hormona del crecimiento la cual produce una grave deficiencia de la misma y de IGF-1, revela un incremento de la respuesta antioxidante y de los mecanismos de autofagia en células cultivadas con suero de individuos de dicha población. Estas células presentan un incremento de la expresión de PPTC7. Pptc7 es el primer sistema descrito de regulación post-traduccional de la biosíntesis de coenzima Q10 en células de mamífero, además del primer nexo entre esta ruta y la degradación específica de mitocondrias. Ambas rutas se encuentran relacionadas en multitud de situaciones, y se han descrito ampliamente en la enfermedad (MELAs, Fibromialgia, Parkinson, etc.). Los datos de esta tesis doctoral destacan a Pptc7 como posible diana para el estudio de tratamientos que activen dicha enzima, paliando las deficiencias generadas en las diversas patologías que cursan con un déficit de coenzima Q10, tanto por incrementar su síntesis endógena como por estimular la mitofagia, eliminando así selectivamente aquellas mitocondrias disfuncionales.