Evaluation of biological nitrogen fixation in biserrula pelecinus l. Under stressful conditions

Résumé

En Portugal, cerca del 20% del área territorial es superficie agrícola en uso. Se estima que alrededor de dos millones de hectáreas están ocupadas por pastos naturales de baja productividad, la mayoría de los cuales se ubican geográficamente al sur del rio Tajo, en la región del Alentejo. A excepción de los montes suroccidentales, donde el relieve es escarpado, el Alentejo está formado por planicies con escasa altitud donde dominan los litosuelos de baja profundidad y fertilidad. El clima predominante en el Alentejo es semiárido Mediterráneo, caracterizado por inviernos suaves con elevadas precipitaciones y veranos calidos y secos. Esta región compuerta características con su homóloga española en la Comunidad Autónoma de Extremadura y se encuentra permanentemente bajo elevado riesgo de desertificación, el hecho de encontrarse encuadrado en la zona Mediterránea, la hace también extremadamente vulnerable al cambio climático. Los pastos del Alentejo presentan rendimiento bajos como resultado de la agricultura intensiva, así como de prácticas inadecuadas en la extensiva. Las malas prácticas de manejo utilizadas han dado como resultado el agotamiento de las propiedades del suelo. Si bien no es sencillo mejorar la calidad del suelo o devolverle sus características de naturalidad, si es posible introducir mejoras en los pastos, como por ejemplo la puesta en cultivo de mezclas biodiversas y ricas en leguminosas de resiembra anual, inoculadas debidamente con cepas de rizóbio adaptadas a las condiciones ambientales y con una considerable eficiencia simbiótica. Las bacterias edáficas del grupo Rhizobiaceae establecen simbiosis con leguminosas y son responsables de la fijación del nitrógeno atmosférico en un proceso de reducción a amonio. El amonio es fácilmente usado por las plantas, que disponen así de un fertilizante natural. Este proceso es conocido como fijación biológica del nitrógeno y es la alternativa natural más significativa a la fertilización química, con una fijación de 200-300 kg Nha-1 al año. La fijación biológica del nitrógeno tiene un papel singular en el desarrollo de sistemas agrícolas sostenibles, contribuyendo al aumento de la productividad de los cultivos, ayudando a la rehabilitación de las tierras marginales y a la recuperación de la fertilidad del suelo. La búsqueda de leguminosas adecuadas a condiciones ambientales adversas (regiones en proceso de desertificación, disminución de la fertilidad, etc.) es una práctica de importancia incuestionable. Debido a la capacidad de fijación de nitrógeno, las leguminosas de interés forrajero ocupan un lugar destacado tanto en la agricultura como en la recuperación de suelos degradados. Biserrula pelecinus L. es una leguminosa pratense, forrajera, con potenciales características agronómicas para la regeneración de pastos degradados. Es conocida por su robustez para sobrevivir en suelos ácidos y pobres, desarrollando un sistema radicular profundo que aumenta su supervivencia durante otoños y primaveras secas, cuando el agua se muestra como factor limitante para el crecimiento de la vegetación. El interés de biserrula, ampliamente estudiada en el sur de Australia, está gradualmente incrementando en Europa y países de América del Sur. En la actualidad en Portugal, el estudio de biserrula se desarrolla más intensamente en el Instituto Nacional de Recursos Biológicos, antigua Estação Nacional de Melhoramento de Plantas (INRB- INIA, ENMP). Los objetivos principales de los investigadores del INRB son en el estudio de la biodiversidad de especies de leguminosas pratenses, su caracterización agronómica y fenológica, habiéndose desarrollado un programa de selección de ecótipos de leguminosas adaptadas a suelos pobres y de mala estructura, característicos de la región del Alentejo. La optima adaptación de biserrula a los sistemas agrícolas de la Península Ibérica depende considerablemente de la adecuada selección de rizóbios nativos que sean altamente efectivos y eficientes en la fijación biológica del nitrógeno, y en simbiosis con biserrula que adicionalmente sean tolerantes a factores ambientales estresantes de carácter abióticos, propio del clima semiárido Mediterráneo. El éxito de esta selección de simbiontes efectivos radica en el conocimiento previo de las mejores cepas rhizobianas y sus respuestas a situaciones ambientales cambiantes. El desarrollo de este conocimiento se hace imprescindible una investigación previa que identifique las cepas más adecuadas para cada situación ambiental. El presente trabajo analiza la comunidad simbiótica natural asociada a la leguminosa forrajera Biserrula pelecinus, llevando a cabo la selección de las mejores cepas rizobianas, adecuadas a diferentes condiciones de estrés abiótico. Con todo se busca la obtención de inoculantes de B. pelecinus que induzcan el mejor desarrollo de la planta bajo condiciones variables de deficiencia y exceso de nutrientes, y extrema sequía. La memoria se estructura en siete capítulos. El capítulo uno presenta una revisión bibliográfica que aborda el mecanismo de la fijación biológica del nitrógeno, desde el proceso bioquímico al compleja genética implicada en la interacción rizóbio-leguminosa. Además se presenta la caracterización detallada de la leguminosa hospedadora y bacteria huésped, su morfología, ecosistema y nicho natural. En el capítulo dos se describí el aislamiento de las cepas rizobianas asociadas a la planta hospedadora colectada en su ambiente natural, la caracterización molecular usando técnicas rutineras de fingerpritting molecular y la relaciones filogenéticas con los principales géneros de rizóbio. La colecta se ha realizado en España, región de Ávila, y en Portugal, en la región de Alentejo (Arronches, Elvas, Ajuda, Monsaraz, Terena y Safara). Se han aislado un total de 88 cepas con las características típicas del crecimiento rizobiano que fueran caracterizadas por la técnica rep-PCR usando los primers BOX and ERIC. Cincuenta y una fueran consideradas diferentes por su perfil genético distinto. En comparación con una cepa comercial de biserrula, Mesorhizobium sp., se han seleccionado cinco cepas para identificación taxonómica mediante secuenciación del gene 16S RNA ribosómico. Las cepas (AjuPt6, SafPt6, SafPt12, AviSp7) con mayor similitud a la cepa comercial, fueran identificadas como pertenecientes a la especie Mesorhizobium ciceri bv. biserrulae. La cepa (ArrPt12) que se más desigual al Mesorhizobium sp. comercial, se ha identificado como Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli. En el tercero capitulo se evalúa la competencia saprofita de los aislados rizobianos mediante su caracterización fenotípica y su respuesta a diferentes tipos de stress abiótico como salinidad, acidez y alcalinidad, y presencia de metales pesados. Las cepas aisladas de biserrula han presentado un crecimiento típico de rizóbio con diferentes tiempos de generación (cepas de crecimiento rápido, moderado y lento). Son capaces de crecer copiosamente en niveles de salinidad hasta 2.5% (w/v) NaCl, bien como capaces de tolerar condiciones extremas de acidez (pH 4.5 and 5.5), además de cambiar, bajando, el pH del medio altamente alcalino (pH 9.5 and pH 12.5). Su crecimiento es inhibido a concentraciones de aluminio disponibles mayores que 250 ¿M, en contraste con su capacidad de tolerar concentraciones de manganeso disponible superiores a 1000 ¿M. En el capitulo cuatro se estima la eficiencia simbiótica, capacidad infecciosa y efectividad en la fijación de nitrógeno molecular, de las 51 cepas aisladas y previamente caracterizadas. Además, se comparan dos metodologías para estimar el aporte simbiótico de los aislados à la planta hospedadora mediante la diferencia de los pesos secos (planta inoculada en comparación con planta no inoculada) y el uso de isotopos naturales (abundancia natural de nitrógeno, ¿15N). Se ha comprobado que la técnica de abundancia natural de nitrógeno es más sensible e rigorosa do que la diferencia de pesos secos, se verificando que la eficiencia simbiótica de la mayoría de las cepas no ultrapasaba el 65% de nitrógeno derivado de la fijación simbiótica (%Ndfa) en comparación con la cepa de referencia Mesorhizobium sp. Se han elegido un grupo de cepas con una porcentaje de Ndfa superior a 67% (AjuPt16, SafPt5, AjuPt21, SafPt6, SafPt8 y SafPt12), de los cuales se han seleccionado tres cepas con porcentaje de Ndfa distintas (AjuPt16, 67%; SafPt6, 71%; y SafPt12, 73%). En el capitulo cinco se estudia el efecto de la disponibilidad de nutrientes en la fijación de nitrógeno de las cepas AjuPt16, SafPt6 y SafPt12. La planta hospedadora inoculada y no inoculada es sometida a tres niveles crecientes de fertilización (F0, F25, F75). El progresivo aumento de nutrientes, en particular la concentración de nitrógeno, han provocado una disminución de la fijación biológica del nitrógeno en todas las cepas, incluyendo la cepa de referencia. La formación de nódulos ha incrementado pero el peso seco nodular se ha manteniendo sugiriendo la formación de nódulos pequeños y no efectivos. Se ha verificado un efecto cinegético entre las cepas y el contenido de nitrógeno disponible en el fertilizante en el regime F25. En condiciones elevadas de fertilización (F75), los mejores resultados se han verificado en la cepa SafPt12, indicación del elevado nivel de tolerancia al nitrógeno combinado. En el sexto capítulo se estudia los efectos del estrés hídrico en la fijación de nitrógeno de las cepas huéspedes AjuPt16, SafPt6 y SafPt12 y de la planta hospedadora. Biserrula inoculada y no inoculada fue sometida a tres niveles decrecientes de stress hídrico (R1, R2 y R3). Se comprueba que Biserrula pelecinus presenta una tolerancia considerable a las condiciones de stress hídrico, desarrollando mecanismos de escape al stress capaces de suportar bajos potenciales hídricos disponibles. En respuesta a la condiciones moderadas y severas de stress hídrico (R2 y R3), se verificó la existencia de partición de la biomasa vegetativa para la región radicular, posiblemente con intuito del aumento de la absorción de agua. La cantidad de nitrógeno fijado derivado de la fijación biológica de nitrógeno, en todas las cepas, ha disminuido considerablemente en stress severo. El aislado que ha demostrado la capacidad de fijar eficientemente fue el SafPt12. El capitulo siete presenta una discusión general de los resultados obtenidos en los capítulos anteriores, con la recapitulación de las conclusiones y recomendaciones futuras para nuevos proyectos de investigación. Los objetivos específicos del trabajo son: 1) Estudiar la biodiversidad rizobiana asociada a la Biserrula pelecinus. 2) Caracterizar fenotípicamente las cepas extraídas de los nódulos de B. pelecinus crecidas en condiciones de absoluta naturalidad. 3) Analizar la especificidad y la promiscuidad de los simbiontes de B. pelecinus. 4) Evaluar la amplitud ecológica de la simbiosis Biserrula-rizobio, así como el comportamiento de la planta sometida a la inoculación en suelos con condiciones de estrés abiótico (contenido variable de nutrientes y estrés hídrico). 5) Seleccionar cepas rizobianas resistentes a situaciones de estrés ambiental.