Expresión de los genes thnOrganización transcripcional y activación mediada por el regulador tipo tipo LysR ThnR

Résumé

El solvente orgánico tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno) es un contaminante altamente tóxico utilizado por Sphingomonas macrogolitabida estirpe TFA como fuente de carbono y energía. Los genes que codifican para las enzimas implicadas en la metabolización de la tetralina hasta intermediarios del metabolismo central se encuentran agrupados en dos operones de transcripción divergente y cercanos entre si, thnBDEFA1A2 (operón B) y thnCA3A4RY (operón C) (Martínez-Pérez et al., 2004) La expresión de los operones thn está regulada a nivel transcripcional: es inducida por la presencia de tetralina en el medio de cultivo y está sujeta a represión catabólica en presencia de fuentes preferenciales de carbono. La activación de la expresión mediada por la molécula inductora se encuentra controlada por un sistema de regulación complejo en el cual el activador transcripcional ThnR y su co-activador ThnY juegan un papel esencial (Martínez-Pérez et al., 2004). Además, está sometida a modulación negativa mediante un sistema que ajusta el perfil de moléculas capaces de inducir la expresión de los genes thn al perfil de moléculas susceptibles de ser sustrato de la primera enzima de la ruta de degradación. La ferredoxina ThnA3, componente de este complejo dixigenasa inicial es la responsable del fenómeno de modulación que, presumiblemente en función del tránsito de electrones hacia el sustrato, modula la transcripción de los operones B y C. (Martínez-Pérez et al., 2007) Trabajos previos permitieron la identificación de 10 nuevas pautas abiertas de lectura cuyos productos génicos no son esenciales para la degradación de tetralina pero que podrían estar relacionadas con la metabolización del ácido pimélico generado por la ruta de degradación (artículo en preparación). En el desarrollo de este trabajo se ha caracterizado la organización transcripcional de estos genes mediante ensayos de RT-PCR y mapeo de los extremos 5 prima de los transcritos generados, resultando en la identificación de dos nuevos operones: thnHIJKL y thnMNOP y en la inclusión de thnG en el operón B. Estudios de expresión de estos operones mediante el uso de fusiones traduccionales al gen de la beta-galactosidasa sugieren que los cuatro operones están regulados de forma coordinada de manera que su expresión está sujeta a las mismas señales y controlada por el mismo sistema de regulación descrito para los operones B y C. El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización del activador transcripcional ThnR, pieza fundamental del sistema de activación. ThnR es un activador que pertenece a la familia de reguladores transcripcionales LysR (LTTR). Los reguladores de esta familia típicamente activan la expresión de un operón divergente en respuesta a la presencia de una molécula inductora y autorregulan negativamente su propio promotor (Maddocks and Oyston, 2008; Schell, 1993) Sin embargo, en el sistema thn el gen que codifica para el regulador se localiza aguas abajo del operon C y datos previos indicaban que se localiza en la misma unidad transcripcional. Aunque la expresión del gen thnR se produce desde un transcrito liderado por thnC en respuesta a la presencia de tetralina, estudios de expresión mediante RT-PCR cuantitativa, fusiones génicas y mapeo del extremo 5' de los transcritos que contiene thnR indican que existe una actividad promotora independiente de la presencia de tetralina que permite la expresión de ThnR a niveles basales constitutivos suficientes para activar la expresión de los operones B y C. El análisis de las secuencias promotoras de los cuatro operones thn puso de manifiesto la presencia de secuencias que cumplen el consenso descrito para sitios de reconocimiento de reguladores tipo LysR. En esta tesis se ha realizado el estudio de la interacción del regulador ThnR con estas secuencias de unión mediante ensayos in vitro de retado en gel y de protección frente a digestión por DNAsa I, que han demostrado que la activación de la expresión de los genes thn está mediada por la unión de ThnR a secuencias específicas. Se ha realizado un análisis más detallado del papel de los sitios de unión de ThnR en la región intergénica thnB-thnC, ya que la activación coordinada de dos operones divergentes planteaba una situación diferente a los sistemas activados por reguladores de la familia LysR descritos previamente. Los resultados obtenidos de ensayos in vivo e in vitro han permitido plantear un modelo para la activación de la expresión de los promotores PB y PC, que implica la formación de un complejo de orden superior generado por la interacción de ThnR unido a los dos sitios de unión primarios. La transcripción desde PB no requiere la formación de esta estructura, que si es necesaria para la correcta expresión del operón C, probablemente debido a que, a pesar de que el sitio C posee mayor afinidad por la unión de ThnR, la posición no canónica de este sitio respecto al inicio de la transcripción requiera un reordenamiento topológico para alcanzar los niveles óptimos de expresión. Maddocks, S.E., and Oyston, P.C. (2008) Structure and function of the LysR-type transcriptional regulator (LTTR) family proteins. Microbiology 154: 3609-3623. Martínez-Pérez, O., Moreno-Ruiz, E., Floriano, B., and Santero, E. (2004) Regulation of tetralin biodegradation and identification of genes essential for expression of thn operons. J Bacteriol 186: 6101-6109. Martínez-Pérez, O., López-Sánchez, A., Reyes-Ramírez, F., Floriano, B., and Santero, E. (2007) Integrated response to inducers by communication between a catabolic pathway and its regulatory system. J Bacteriol 189: 3768-3775. Schell, M.A. (1993) Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol 47: 597-626.