Characterization of nuclear envelope proteins NPP-16 and LEM-2 and identification of interaction partners

Resumen

Characterization of nuclear envelope proteins NPP-16 and LEM-2 and identification of interaction partners Esta tesis doctoral, se centra en el trabajo con el organismo modelo Caenorhabditis elegans, nemátodo de la familia Rhabditidae que, debido a su transparencia, fácil mantenimiento en el laboratorio y simplicidad, pese a poseer órganos y sistemas totalmente formados, es cada vez más usado en estudios e investigaciones de distintas áreas de la Biología. Concretamente este proyecto se centra en una de las estructuras más características de las células eucariotas: la envoltura nuclear. Se trata de una bicapa lipídica que delimita al núcleo permitiendo la separación de los espacios nuclear y citoplasmático dentro de la célula. Esto es vital, entre otras cosas, para la maduración de las moléculas de ARN mensajero (resultado de la traducción del ADN) eliminando los intrones, de manera que, una vez maduras, estas moléculas salen al citoplasma, donde, gracias a los ribosomas, se produce la traducción para obtener las proteínas. La envoltura nuclear está constituida por una membrana interna y otra externa y a lo largo de esta ellas encontramos distintas proteínas integrales y unos complejos proteínicos llamados Poros Nucleares, que regulan el transporte de moléculas entre el núcleo y el citoplasma. Pero la envoltura nuclear tiene, además otras funciones muy relevantes relacionadas con el control de la expresión génica mediante el anclaje de la cromatina a la misma. Actualmente se sabe que hay diversas enfermedades relacionadas con defectos en los componentes de la envoltura nuclear. Éstas son llamadas laminopatías y en algunos casos las células se ven claramente afectadas mostrando una forma nuclear distinta. Esta tesis está centrada en la descripción y caracterización de dos proteínas de la envoltura nuclear: la proteína integral de membrana LEM-2 y la nucleoporina NPP-16. A lo largo de este estudio se describen diversos aspectos y funciones de ambas así como su relevancia para el funcionamiento de la célula. Al mismo tiempo se han buscado e identificado otras proteínas que muestren algún tipo de interacción con LEM-2 o NPP-16, para lo cual hemos realizado un ¿Screening¿ en todo el genoma de gusano utilizando para ello la técnica conocida como ARN de interferencia (ARNi). Este método, ampliamente usado en los estudios de genética funcional, consiste en reducir casi completamente (la eficiencia puede variar según el caso) la expresión de un gen, mediante la introducción de ARN de doble cadena, homólogo al gen que se quiere desregular, en el animal. Estas moléculas son procesadas hasta obtener pequeños fragmentos de ARN interferente que se unen al ARN mensajero del gen y bloquean su traducción, dejándose de producir por tanto la proteína correspondiente. Tras este proceso se puede observar y estudiar el efecto que tienen en el animal la falta de dicho gen, ayudando por tanto a determinar su función. Para el ¿Screening¿ se ha utilizado la librería de ARNi del laboratorio de Julie Ahringer, la cual cubre el 86% del genoma de C. elegans, analizando el fenotipo producido por la pérdida de cada uno de los genes en una línea silvestre y comprando el resultado de la misma pérdida en el mutante lem-2 y el mutante npp-16. Tras analizar unos 17.000 genes en las tres líneas y tras varios pasos de confirmación, se obtuvieron 42 genes cuya deleción en el mutante lem-2 producía un fenotipo ausente en la línea silvestre, y 13 genes cuya deleción en el mutante npp-16 producía un efecto ausente en la línea silvestre. Esto indica la existencia de una posible interacción entre cada uno de los genes encontrados y NPP-16 o LEM-2 según el caso. El análisis de los 55 candidatos se ha realizado manteniendo la técnica de ARNi, utilizando diversos mutantes y líneas transgénicas que mediante microscopía nos permiten visualizar el efecto, en el desarrollo de los embriones, de la pérdida de los diferentes genes. Finalmente nos centramos en dos genes: NPP-2 que muestra letalidad sintética con NPP-16 (la ausencia de cada uno individualmente no produce fenotipos severos mientras que la ausencia de los dos resulta una elevada letalidad embrionaria) y UBC-12 , que muestra letalidad sintética con LEM-2. A lo largo de todo el documento se describen los materiales y métodos que se han utilizado, así como los resultados obtenidos que finalmente se tratan en la discusión y se concretan en las conclusiones.