Protein kinase VRK1 and its role in cell proliferation and differentiation

Resumen

Caenorhabditis elegans es un nematodo pequeño que se alimenta de microorganismos, es transparente y fácil y barato para cultivar en el laboratorio. Además, su naturaleza hermafrodita, un ciclo de vida rápido, posibilidad de congelación y recuperación de los nematodos viables facilitan muchas manipulaciones genéticas. Por estas ventajas se utiliza como un sistema modelo en casi todas las áreas de la biología célullar, neurobiología y desarrollo. La elucidación de la organogénesis es importante para la comprensión del desarrollo de los organismos multicelulares. La vulva de un adulto hermafrodita sirve como un pasillo que conecta el útero con el ambiente externo y su desarrollo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos que subyacen a la especificación del destino celular y las vías de señalización intercelular (Sternberg, 2005). Durante el estadio larvario L3 una célula especializada de la gónada llamada célula ancla (AC), induce el desarrollo de la vulva mediante la secreción de la proteína LIN-3, un ligando del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a los precursores celulares de la vulva (VPC) subyacentes, llamados P3.p-P8.p para adoptar los destinos vulvares (Hill and Sternberg, 1992). El nivel mas alto de LIN-3 lo recibe P6.p para adoptar 1¿ destino celular y activar el LIN-12 (Notch) en P5.p y P7.p y adoptar el 2¿ destino celular (Sternberg, 1988). Los tres restantes VPCs (P3.p , P4.p y P8.p) que no reciben el señal inductiva ni las señales laterales adoptan el 3¿ destino celular, se dividen una vez y se fusionan con la hipodermis (hyp7). Después de tres rondas de divisiones celulares durante los estadios larvarios L3 y L4 se generan 22 células de la vulva de siete tipos diferentes que se invaginan y fusionan para formar siete anillos toroidales diferentes, se conectan al útero y emergen durante la última muda para formar la vulva madura del hermafrodita. La AC desempeña un papel crucial no sólo durante el desarrollo de la vulva, sino también en la morfogénesis uterina. Después de la inducción de tres VPCs para adoptar sus destinos vulvares, la AC señala, a través de LAG-2 y su receptor LIN-12, a seis de los doce descendientes de las células ventrales del útero (VU) a adoptar el destino celular ¿. Durante el estadio larvario L4, ocho células ¿ fusionan con la AC y forman el sinsitio llamado utse. La fosforilación de proteínas por parte de quinasas es una modificación postraduccional que juega un papel importante en procesos biológicos numerosos. Se estima que aproximadamente el 30 % de las proteínas intracelulares se fosforila de forma reversible (Cohen, 2000), lo que hace que las proteínas quinasas sean reguladores clave de procesos biológicos incluyendo la transducción de la señal, la transcripción, la progresión del ciclo celular, el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis. La familia de quinasas humanas Vaccinia Related Kinases, VRKs, está constituida por tres miembros proteínas, VRK1 ¿ 3, de los cuales sólo VRK1 y VRK2 son catalíticamente activos (Nichols and Traktman, 2004). En Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster hay sólo un ortólogo (VRK-1 y NHK-1, respectivamente). No hay ortólogos de las VRKs identificados en la levadura. VRK1 humana es el miembro más estudiado de la familia de VRK. Experimentos en diferentes organismos han demostrado que VRK1 fosforila varios factores de transcripción (p53, c-Jun y ATF2) y proteínas asociadas a la cromatina (histonas H2A y H3, BAF1) (Klerkx et al., 2009b). VRK1 regula la progresión del ciclo celular y juega un papel importante en la dinámica de la envoltura nuclear (Gorjanacz et al., 2007; Nichols et al., 2006). En los mamíferos, la pérdida de VRK1 conduce a la esterilidad y puede causar trastornos neurológicos (Renbaum et al., 2009; Wiebe et al., 2010). Además, la expresión de VRK1 se correlaciona con la progresión de ciertos tipos de cáncer (Santos et al., 2006). Los estudios realizados en nuestro laboratorio utilizando los nematodos C. elegans como organismo modelo han demostrado que VRK1 juega un papel crítico en el desarrollo de órganos, así como en la proliferación de células germinales y divisiones mitóticas durante la embriogénesis temprana (Gorjanacz et al., 2007; Klerkx et al., 2009a). Sin embargo, poco se sabe acerca de la dinámica de VRK1, su regulación y sus sustratos durante el desarrollo. Los objetivos de mi tesis doctoral han sido situar a VRK-1 dentro del contexto del desarrollo de órganos de C. elegans, caracterizar la dinámica de la localización de VRK-1 tanto en C. elegans como en las células humanas e identificar nuevos sustratos de esta quinasa. La primera parte de mi tesis se concentra en la caracterización de la localización y la movilidad de VRK1 tanto en C. elegans como en las células humanas. Con el fin de caracterizar la dinámica de VRK1 y garantizar los niveles de expresión uniformes hemos utilizado los sistemas MosSCI y Flp-In para generar nuevas cepas transgénicas de C. elegans y líneas celulares humanas, que expresan solo una copia de los transgenes. Hemos observado que las nuevas cepas muestran la expresión de VRK-1 no sólo en las células previamente reportadas (neuronas, células hipodérmica y células precursoras de la vulva), sino también en las celulas del utero y la célula ancla. Ademas, hemos observado que VRK1 humano es nuclear durante la interfase y en mitosis se asocia con los cromosomas condensados, igual a lo descrito para los embriones de C. elegans (Gorjanacz et al., 2007). Por otra parte, una mutagénesis dirigida a tres argininas conservadas en la región carboxyl terminal identificó un nuevo motivo conservado, responsable de la localización de VRK1 en cromatina durante la mitosis. La recuperación de fluorescencia posterior al foto-blanqueamiento (FRAP) sugiere una asociación transitoria de VRK1 con la cromatina. Se observaron cinéticas idénticas en interfase y en la mitosis, lo que sugiere que VRK1 puede interactuar con las mismas proteínas de la cromatina durante todo el ciclo celular. La segunda parte de mi tesis se concentra en la relación entre VRK1 y las vías de señalización implicadas en el desarrollo de C. elegans. Durante el desarrollo de la vulva la AC se fusiona con células uterinas para formar el utse. Los defectos en la formación de utse producen un fenotipo conocido como vulva protuberante (Pvl). Hemos demostrado que la AC no se fusiona en los mutantes de vrk-1, muy probablemente debido a la pérdida de VRK-1 en el tejido uterino, lo cúal, esta perdida se caracteriza por defectos en la proliferación y la diferenciación en las células uterinas. La tercera parte de esta tesis se centra en la identificación de las proteínas que interaccionan con VRK1. Hemos expresado y purificado VRK1 de células humanas asincrónicas y mitóticas, seguido por espectrometría de masas de alta resolución. Algunos de los principales candidatos identificados fueron miembros del complejo de pasajeros cromosómica (CPC) - Aurora B, Borealin y survivin. Experimentos en curso servirán para confirmar la interacción de VRK1 con el CPC. En conclusión, en esta tesis hemos destapado nuevos dominios reguladores de la proteína quinasa VRK1 y proteínas que interaccionan con VRK1. Estos resultados son importantes para comprender las actividades moleculares de esta quinasa, que está vinculada a la organogénesis, así como a los cánceres humanos y a trastornos neurológicos.