Represión catabólica de la ruta de degradación de tetralina en "Sphingopyxis macrogolitabida" TFA

Resumen

El proyecto de tesis denominado ¿Represión catabólica de la ruta de degradación de tetralina en Sphyngopyxis macrogolitabida TFA¿ presentado por la doctoranda Dña. Helena Gómez Álvarez ha sido realizado en el área de Microbiología perteneciente al Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica de la Universidad Pablo de Olavide. El objetivo de esta Tesis ha sido el estudio del fenómeno de represión catabólica en Sphingopyxis macrogolitabida TFA. Este tipo de regulación global está bien caracterizado en las principales bacterias modelo, pero su base molecular es totalmente desconocida dentro del orden Sphingomonadales, a pesar de que este grupo alberga varios géneros de bacterias con un relevante potencial en biorremediación. Dado que en TFA el metabolismo del compuesto aromático tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno) está completamente caracterizado, se ha empleado esta ruta de degradación como referencia para el estudio de la base molecular que dirige el proceso de represión catabólica en presencia de otra fuente de carbono preferencial (ß-hidroxibutirato) en el medio. Durante el desarrollo de esta Tesis se ha realizado un análisis de la fisiología de la bacteria durante el crecimiento en condiciones de represión catabólica. Para ello, se ha estudiado la inducción de los genes de degradación de tetralina (sujetos a represión catabólica) in vivo y a lo largo del tiempo en distintas condiciones de disponibilidad de carbono. También se han identificado y analizado los cambios ocurridos en el proteoma de la bacteria como consecuencia del estímulo de represión catabólica. Con este fin, se han desarrollado experimentos de resolución del proteoma en geles bidimensionales y se han analizado las diferencias globales gracias al marcaje de las proteínas con fluoróforos (técnica 2D-DIGE) o con metionina radiactiva. El último tipo de estudio se desarrolló gracias a una estancia de investigación en el laboratorio del Prof. Michael Hecker (Greifswald, Alemania). Aparte del estudio fisiológico, se ha analizado la implicación de varios elementos específicos en el mecanismo de represión catabólica, elegidos bien por su expresión diferencial en condiciones de represión catabólica en los experimentos de proteómica o por su implicación en el mismo proceso de regulación global en otras bacterias. Así, se han construido mutantes de deleción o mutantes condicionales en los genes de TFA codificantes para: el regulador transcripcional CdnL, una proteína transductora de señales con dominios CBS, el sistema de dos componentes FixL-FixJ y las proteínas HPr y HPrK del sistema fosfotransferasa tipo Ntr (PTSNtr). Para la caracterización del fenotipo de estas estirpes mutantes se han realizado análisis del crecimiento, ensayos de expresión de los genes thn (mediante qRT-PCR o ensayo ß-galactosidasa) y medida de la acumulación del polímero de reserva polihidroxibutirato (PHB). Únicamente se ha podido confirmar la participación de la proteína HPr en el proceso de represión catabólica, cuya deleción altera también la acumulación de gránulos de PHB en las células.