Alterations in growth and cell death by genetic deletion of the antioxidant response factor nrf2 and its target, the quinone reductase nq01

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª Julia Ariza Gómez El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. introducción o motivación de la tesis El factor-2 relacionado con el factor nuclear E2 (Nrf2) es un factor de transcripción esencial para la regulación de muchas enzimas antioxidantes y destoxificadoras de fase II inducidas por estrés . Esta respuesta es muy compleja y se encuentra coordinada mediante un elemento cis llamado elemento de respuesta antioxidante (ARE) o elemento de respuesta a electrofílicos (EpRE), que se localiza en la región reguladora de los genes diana correspondientes . Nrf2 es el principal factor de transcripción capaz de aumentar la transactivación de genes que se expresan de forma regulada por la secuencia ARE . Nrf2 es un factor de transcripción que pertenece al grupo de los factores CNC (Cap N¿ Collar). Éstos constituyen un subgrupo dentro de la familia de factores de transcripción que poseen una cremallera de leucina básica (bZIP) . En condiciones normales Nrf2 se está degradando de forma continua y presenta una vida media de menos de 20 minutos . Por tanto, la degradación forma parte de la regulación de la actividad Nrf2. Nrf2 se encuentra unido a un dímero de Keap1 en el citoplasma que, de esta forma, reprime su actividad transcripcional . Además de secuestrar Nrf2 en el citoplasma, Keap1 también se une a cullin-3 formándose el complejo 2 de ubiquitina ligasa E3. Este complejo es capaz de ubiquitinar Nrf2 y marcarlo para su degradación en el proteasoma . En condiciones de estrés Nrf2 es liberado de Keap1. Esta disociación es posible gracias a dos mecanismos diferentes, por modificación directa mediante ROS y sustancias electrofílicas, o por modificaciones como la fosforilación. Nrf2 es considerado un proto-oncogén debido a que su activación crónica favorece la supervivencia de células potencialmente dañadas y promueve, por tanto, la oncogénesis así como los procesos de quimioresistencia. Sin embargo, Nrf2 es considerado también un gen supresor de tumores siendo la activación de Nrf2 y sus genes diana una estrategia terapéutica para prevenir enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo entre las que también se encuentra el cáncer . Existe también una regulación de Nrf2 sobre algunas proteínas de la familia Bcl-2, como son Bcl-2 y Bcl-xL . Hay estudios que demuestran que la expresión de las proteína antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL está regulada directamente por Nrf2 debido a la presencia de un ARE en la región reguladora de los genes correspondientes . En relación con la edad, la deleción de Nrf2 en músculo esquelético provoca una mayor expresión de varios marcadores de apoptosis como caspasa-3 y -9, Bax, Bad y AIF en animales viejos . Nrf2 regula la transcripción de gran grupo de enzimas antioxidantes y destoxificadoras entre las que se encuentra la NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) . NQO1 es una flavoenzima que cataliza la reducción de compuestos quinónicos a hidroquinonas mediante una reacción de dos electrones, utilizando tanto NADH como NADPH como donador de electrones . El estudio de la inhibición de esta enzima se ha extendido al desarrollo de líneas celulares y organismos que carecen del gen NQO1. Desde su descubrimiento, esta enzima se ha mostrado como un ejemplo de versatilidad y economía en la fisiología celular . De hecho NQO1 tiene un papel en la destoxificación estrechamente relacionado con su función de reducción de quinonas , también funciona como un scavenger de O2.- y como enzima bioactivadora . Además, tiene un importante papel como antioxidante al reducir el coenzima Q o la ¿-tocoferilquinona , así como interaccionando con varias proteínas entre las que se encuentra p53, sobre la que actúa regulando su estabilidad . Un polimorfismo de NQO1 denominado como NQO1*2 resulta en la total carencia de actividad y polipéptido NQO1. Algunas de las líneas celulares ampliamente utilizadas en investigación, como las BE o las Caco-2 de carcinoma de colon, MDA-MB-864 y MDA-MB-231 de cáncer de mama así como las NCl-H1570 y NCl-H596 de cáncer de pulmón, poseen dicho polimorfismo. De hecho, el polimorfismo NQO1*2 es un factor predictivo en varios tipos de cáncer. La relación entre esta patología y el polimorfismo es de gran importancia teniendo en cuenta que el 4% de los caucásicos y aproximadamente un 20% de los asiáticos son homocigotos para NQO1*2 (revisado por ). El principal objetivo de este estudio es el análisis del efecto de la falta del factor de transcripción Nrf2 o de su diana NQO1 en el crecimiento, apoptosis y proliferación de MEFs. Con este objetivo, se midieron varios marcadores de distintas vías de señalización apoptótica y de proliferación. Además, fueron también llevados a cabo algunos estudios funcionales. 2. Contenido de la investigación Se conoce que Nrf2 controla la expresión de algunas proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 and Bcl-xL . Por tanto, quisimos comprobar si la deleción genética de Nrf2 aumenta los niveles de apoptosis basal. Al medir los niveles basales de apoptosis en MEFs Nrf2KO y en dos tejidos mitóticos como son pulmón e hígado, nos encontramos que estaban incrementados significativamente en los KOs. Un estudio previo había demostrado que la inhibición de Nrf2 mediante silenciamiento provocaba una mayor respuesta apoptótica en células de tumor hepático de ratón y humanas tras tratamiento con etopósido y radiación . Además, los ratones viejos Nrf2KO muestran unos niveles mayores de varios factores pro-apoptóticos en músculo esquelético . El descenso de los niveles de Bcl-2 y del ratio Bcl-2/Bax en MEFs Nrf2KO es coherente con una mayor activación de la vía mitocondrial de la apoptosis. Así, la deleción genética de Nrf2 incrementó además los niveles de citocromo c citosólico y de AIF nuclear. Los niveles de Apaf-1 también resultaron incrementados en los MEFs Nrf2KO. Ya que las caspasas de la ruta mitocondrial no aparecieron activadas, nuestros resultados apoyan el hecho de que la cascada apoptótica de la ruta mitocondrial parece estar bloqueada en estas células. Es por tanto probable que el incremento de la fragmentación del ADN detectado en las células Nrf2KO se deba a unos niveles altos de AIF. Una posibilidad que explicaría la falta de activación de la caspasa-3 sería la presencia de inhibidores de proteasas apoptóticas (IAPs). Entre ellos, uno de los más importantes es XIAP, el inhibidor ligado al cromosoma X de proteasas apoptóticas, que se sabe es un potente inhibidor de caspasa-9 y caspasas efectoras . Los niveles de XIAP se mantuvieron similares en los MEFs control y en los Nrf2KO. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con BV6, un inhibidor de XIAP, se indujo la muerte celular en los Nrf2KO pero no en los MEFs control. La inducción de la muerte en los MEFs Nrf2KO al ser tratados con el BV6 puede deberse al alto contenido en factores proapoptóticos, aunque la ruta intrínseca estaría bloqueada en condiciones normales, probablemente debido a que los niveles de XIAP de estas células son suficientes para inhibir la cascada de caspasas al nivel de caspasa-3. Aunque las MAKP Erk1/2 y p38 presentaron una mayor activación en los MEFs Nrf2KO, probablemente no participan en la regulación basal de la apoptosis en estas células ya que los niveles de fragmentación de ADN no se vieron afectados con tratamientos con inhibidores farmacológicos bien caracterizados de la ruta de las MAPK. Sin embargo, mediante el uso de estos inhibidores demostramos que p38 es un regulador negativo de la función Bcl-2 en los MEFs control a través de la inhibición de la actividad transcripcional de Nrf2 y la fosforilación de Bcl-2. Sin embargo, esta proteína anti-apoptótica no depende de la actividad p38 en los MEFs Nrf2KO. La actividad monoamino oxidasa (MAO) está relacionada con la permeabilización mitocondrial, la cual puede ser abolida mediante el uso de inhibidores de sus dos isoformas MAO-A y MAO-B en mitocondrias de hígado de rata . Es interesante el hecho de que Nrf2 disminuye los niveles de ARNm de MAO-B, como se ha demostrado en un estudio transcriptómico . Teniendo esto en cuenta, nos planteamos que MAO-B podría ser responsable, al menos en parte, del incremento de la permeabilización mitocondrial observada en los MEFs Nrf2KO. De acuerdo con nuestra hipótesis, el inhibidor de MAO-B deprenil disminuyó la fragmentación del ADN en MEFs control y Nrf2KO. En nuestro análisis ultraestructural centrado en la mitocondria, hemos observado mitocondrias con una menor área en los Nrf2KO MEFs. Sin embargo, éstas fueron más abundantes, existiendo una mayor superficie de citoplasma ocupado por estos orgánulos en las células Nrf2KO. Esto sugiere que el alto número de mitocondrias en los MEFs Nrf2KO podría ser una consecuencia de alteraciones en los procesos de fusión y fisión mitocondrial. Las medidas de los marcadores de fusión y fisión sugieren un descenso en la fusión sin diferencias en los marcadores de fisión. Unos menores niveles de la proteína de fusión Mfn2 son compatibles con los resultados de un estudio previo que describe que el silenciamiento de Mfn1 y 2 genera mitocondrias más pequeñas y un incremento de los niveles de apoptosis . Los cultivos de MEFs carentes de NQO1 mostraron una mayor longevidad en cultivo y una mayor tasa de proliferación al compararlos con los controles. Esto es consistente con el papel de NQO1 en la progresión tumoral. Se ha sugerido que la ruta de señalización de Nrf2 puede disminuir los efectos del estrés oxidativo. En un modelo celular de fibroblastos humanos se ha mostrado que Nrf2 decae en la senescencia y que el silenciamiento de este factor de transcripción induce una senescencia prematura. Además, el tratamiento con un inductor de Nrf2 aumenta la supervivencia de las células en condiciones de estrés oxidativo, mientras que el tratamiento continuado aumenta la longevidad en fibroblastos humanos . De la misma manera, la activación de la señalización mediada por Nrf2 promueve la longevidad en machos de Dro­sophila megalonaster . La señalización dependiente de Nrf2 se ha identificado además como determinante para la resistencia a estrés en un modelo de ratones con una mayor longevidad . De acuerdo con la importancia de Nrf2 en la longevidad, hemos observado una mayor translocación de Nrf2 al núcleo en MEFs NQO1KO y en el hígado de ratones NQO1KO. Existe la posibilidad de que este incremento de Nrf2 en el núcleo se haya desarrollado como una respuesta hormética para compensar la falta de la enzima antioxidante NQO1. Sorprendentemente, también hemos detectado unos niveles más altos de fragmentación del ADN en los MEFs NQO1KO. Sin embargo, la simultaneidad de una mayor apoptosis y un crecimiento exacerbado se ha observado en algunos tipos de tumores, que presentan un crecimiento descontrolado que origina altos niveles de apoptosis . Cuando analizamos diferentes marcadores de la apoptosis encontramos que el incremento del ratio Bcl-2/Bax en los MEFs NQO1KO no es consistente con su mayor liberación de citocromo c al citosol y sus niveles más altos de AIF nuclear. Por esta razón también analizamos los niveles de Bid, otra proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2. Los MEFs NQO1KO presentaron mayores niveles de Bid. Sin embargo, a pesar de la mayor activación de caspasa-8, no se encontraron mayores niveles de Bid truncado (tBid). Se ha descrito que, aunque para la adquisición de la actividad total de Bid se necesita que se active proteolíticamente y se genere tBid, Bid también tiene cierta capacidad para inducir apoptosis . La ruta mitocondrial de la apoptosis estuvo claramente activada con unos niveles mayores de caspasa-9 y -3 procesada, aunque las células también podrían sufrir apoptosis independiente de caspasas mediante AIF. Sin embargo, a pesar de la alta activación de caspasa-8, iniciadora de la vía extrínseca, la conexión de la vía extrínseca e intrínseca se encontró bloqueada en los MEFs NQO1KO. Sin embargo, es bien conocido que la caspasa-8 tiene diferentes funciones en vertebrados y no solamente regula la respuesta apoptótica sino que también regula otros procesos como el tráfico vesicular, autofagia y la migración y adhesión celular . Altos niveles de caspasa-8 se corresponden también con la alta capacidad de curación de las células NQO1KO. Akt es una proteína relacionada con proliferación y supervivencia . La expresión de Nrf2 activa el metabolismo anabólico, mantiene la homeostasis rédox y promueve la activación de la ruta PI3K¿Akt, sugiriendo una retroalimentación positiva entre Nrf2 y la ruta PI3K¿Akt . En el caso de las células NQO1KO, hemos observado niveles más altos de fosfo-Akt y translocación nuclear de Nrf2. El incremento de estas dos proteínas puede conferir cierta ventaja de crecimiento a estas células, siendo esto consistente con una extensión de la longevidad en cultivo y unas velocidades de proliferación más elevadas. Se sabe que Akt fosforila a la kinasa señalizadora de la apoptosis (Ask1), atenuado su actividad y promoviendo la supervivencia, ya que Ask1 transduce la señal a Jnk y p38 . Esto es consistente con nuestros datos obtenidos en MEFs NQO1KO, los cuales mostraton mayores niveles de Akt y menores de p38 y Jnk-1. Los bajos niveles de activación de p38 podrían constituir otro factor que contribuye al fenotipo de los MEFs NQO1KO. Dolado y sus colaboradores caracterizaron la MAPK p38 como un sensor de ROS y destacaron su importancia en la prevención de la tumorigénesis en MEFs transfectados con un oncogén . Los bajos niveles de P-p38 observados en los MEFs NQO1KO pueden constituir un mecanismo para prevenir la apoptosis, en un intento para desacoplar la ruta dependiente de p38. Además de su papel en la apoptosis, p38 es necesaria para la inhibición por contacto en un modelo de MEFs p38KO . Por lo tanto creemos que la falta de p38 puede ser responsable en parte de la alta densidad de saturación de estas células en cultivo. Además, varios estudios llevados a cabo por diferentes grupos (incluido el nuestro) han demostrado que la expresión de NQO1 depende de la confluencia del cultivo en células adherentes normales y tumorales, viéndose incrementada en varios tipos celulares en cultivos a alta densidad . La inyección de MEFs NQO1KO en ratones inmunodeficientes generó el desarrollo de teratomas, mientras que los MEFs silvestres se mostraron inactivos. Cuando examinamos los cortes de estos teratomas mediante microscopía, se observaron diversas células y tejidos de origen mesodérmicos (como células de tipo fibroblástico, tejido adiposo pardo y blanco, músculo), destacando el mayor potencial proliferativo y de diferenciación de los MEFs carentes de NQO1. Los MEFs NQO1KO presentaron además mitocondrias más pequeñas, siendo más abundantes y ocupando una mayor superficie de citoplasma. Alteraciones en los procesos de fusión y fisión podrían explicar estas diferencias entre los dos genotipos. De hecho, hemos observado como dos proteínas de fusión, Opa1 y Mfn2, estaban disminuidas respecto a los controles. Esto es consistente con un estudio reciente que relaciona NQO1 con el mantenimiento de la integridad mitocondrial . 3.Conclusión La deleción de Nrf2 incrementa la apoptosis basal en cultivos de MEFs y en ratones Nrf2KO. Estos niveles elevados de apoptosis en los MEFs Nrf2KO están relacionados con el incremento de factores pro-apoptóticos que actúan a través de una ruta independiente de caspasas, aunque la cascada de caspasas puede ser reactivada mediante la inhibición de XIAP. La regulación de Bcl-2 a través de la MAPK p38 es dependiente de Nrf2. La quinasa p38 es un regulador negativo de la función de Bcl-2 en MEFs silvestres a través de la inhibición de la actividad transcripcional de Nrf2. La actividad MAO-B es la causa, al menos en parte, del aumento de la apoptosis basal en los MEFs Nrf2KO a través de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. La deleción genética de Nrf2 o de NQO1 causa alteraciones de la ultraestructura mitocondrial, así como de los procesos de fisión y fusión mitocondrial en los MEFs. Los MEFs NQO1KO muestran unos mayores niveles de apoptosis basal mediante mecanismos tanto independientes como dependientes de caspasas. Los MEFs y los ratones NQO1KO presentan una mayor translocación al núcleo de Nrf2, la cual ha podido ser desarrollada como una respuesta hormética para compensar la falta de la enzima antioxidante NQO1. A pesar del incremento de la apoptosis basal, los MEFs carentes de NQO1 muestran un potencial tumorigénico y proliferativo mayor, tanto in vitro como in vivo. Aunque Nrf2 y NQO1 forman parte del mismo eje de señalización antioxidante, la deleción genética de Nrf2 o de NQO1 genera fenotipos celulares muy diferentes en los MEFs.