Papel de la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG) y de la c-Src tirosina quinasa en la regulación antagónica del óxido nítrico sobre la apoptosis

Résumé

En los últimos años se han acumulado evidencias concernientes al papel de la apoptosis en el control de la población de células beta en la patogénesis de la IDDM. Así se ha visto que la apoptosis en células beta de roedores está mediada por la generación de óxido nítrico (NO) en un proceso regulado por citoquinas inflamatorias. Sin embargo respecto al papel del NO en el control de la apoptosis se han encontrado varios mecanismos por los que altas concentraciones de NO la inducen y bajas concentraciones la previenen. En la primera parte de esta Tesis mostramos que altas concentraciones de No inducen la muerte celular por apoptosis en las célula productoras de insulina RINm5F. Nuestros resultados indican que altas concentraciones de No inducen la activación de acciones proapoptóticas como la fragmentación de ADN, activación de caspasa 3, liberación de citocromo c, y degradación de Bcl-2. Además induce la activación de acciones antiapoptóticas como la activación de la PKG. Debido a su mayor intensidad las acciones proapoptóticas predominan sobre las acciones antiapoptóticas. Las acciones proapoptóticas son independientes del sistema de señalización sGC/PKG, aun más nuestros resultados muestran que los índices apoptóticos aumentan de magnitud cuando en condiciones de apoptosis se inhibe la actividad de la PKG con el KT-5823, indicando que el NO activa a la PKG como parte de una respuesta anti-apoptótica. En estudios comparativos realizados tanto in vivo como in vitro utilizando dadores de No y el atractilósido encontramos que la regulación de la liberación de citocromo c por las mitocondrias es un elemento crítico en la apoptosis inducida por el NO y que dicha acción está relacionada con mecanismos dependientes de la apertura del poro de membrana responsable de la permeabilidad transitoria (PT) de la mitocondria. En la segunda parte de esta Tesis mostramos que la retirada de suero del medio de cultivo induce la muerte celular por apoptosis en células productoras de insulina RINm5F, la apoptosis fue seguida a través del estudio de índices como la liberación de citocromo c de la mitocondria, activación de caspasa 3, degradación de Bcl-2 y un nuevo índice llamado actividad de Bcl-2 quinasa, que consiste en determinar la capacidad que tienen los homogeneizados de fosforilar a Bcl-2 inmunoprecipitada. Nuestros resultados muestran por primera vez que bajas concentraciones de DETA/NO (10 µM) inducen la reducción de la liberación de citocromo c, disminución de la activación de caspasa 3, prevención de la degradación de Bcl-2 y aumento de la actividad Bcl-2 quinasa. Estudios con inhibidores del sistema sGC/PKG, el ODQ y el KT 5823, revelan que estas acciones son dependientes de la activación de la sGC y de la PKG. El DETA/NO induce la autofosforilación de la c-Src tanto in vivo como in vitro y la c-Src activa es capaz de inducir la fosforilación en tirosina de Bcl-2 in vitro. Debido a que la inhibición de la c-Src por el PP1 cancela las acciones del DETA/NO sobre la activación de la PKG, disminución de la activación de caspasas, disminución de la liberación de citocromo c de la mitocondria, prevención de la degradación de Bcl-2, e incremento de la actividad de Bcl-2 quinasa, proponemos que tanto la generación de cGMP y la activación de la c-Src son requeridos para la señalización de las acciones antiapoptóticas del NO sobre la mitocondria.