Interacciones relevantes en la transducción de señales del nitrógeno en Synechococcus Elongatus PCC 7942los reguladores PII, PipX y NtcA

Abstract

Previamente al inicio de esta tesis, el grupo de investigación del que formo parte identificó, mediante el sistema del doble híbrido de levaduras, dos proteínas que interaccionaban con PII en S. elongatus: PipX y NAGK. Además PipX, una proteína de función desconocida y restringida a cianobacterias, interaccionaba también con el regulador transcripcional global del nitrógeno de cianobacterias, NtcA. Estas interacciones, restringidas a cianobacterias en el caso de los complejos de PipX y a organismos que realizan fotosíntesis oxigénica en el caso de los complejos PII-NAGK, se detectaron entonces por primera vez, y supusieron un avance significativo en el estudio de la transducción de señales de nitrógeno en cianobacterias y cloroplastos. Mientras que el complejo PII-NAGK se convirtió rápidamente en uno de los ejemplos mejor caracterizados de regulación por proteínas PII, la función de PipX en general y de los complejos PII-PipX en particular, permaneció enigmática. En esta tesis, hemos pretendido arrojar luz sobre las interacciones mediadas tanto por PipX como por PII, con particular énfasis en los complejos PII-PipX y PipX-NtcA. Puesto que las proteínas PII median su función mediante interacciones con otras proteínas (denominadas receptores de PII) y son proteínas promiscuas que interaccionan con distintas proteínas en los organismos estudiados, parece razonable suponer que en S. elongatus PII interaccione, además de con PipX y NAGK, con otras proteínas. Téngase en cuenta además que con las estrategias de construcción de las genotecas usadas en los escrutinios doble híbrido son esperables falsos negativos. En este contexto es en el que hemos explorado la red de interacciones proteicas de PII ensayando diversas proteínas candidatas que, o bien interaccionaban físicamente en otros sistemas, o bien disponíamos de datos de interacción genética. Para establecer relaciones funcionales entre las 3 proteínas de interés en esta tesis (PII, PipX, NtcA) hemos tenido en consideración las funciones previamente conocidas de PII y NtcA y recurrido al análisis genético, cuyos resultados inesperados han generado nuevas preguntas y determinado nuevos enfoques experimentales. Hemos explorado la participación de residuos conservados de PipX en las interacciones con otras proteínas y hemos trabajado estrechamente con nuestros colaboradores del IBV (J.L. Llácer y V. Rubio) en el estudio de los complejos mediante un extenso análisis mutacional con el sistema del doble híbrido, que ha permitido verificar los datos cristalográficos relativos a los complejos PII-PipX y PipX-NtcA. Además hemos abordado la posibilidad de complejos ternarios y las relaciones entre tres proteínas (en particular PipX-PII-NAGK y PII-PipX-NtcA) mediante sistemas triple híbrido. Los estudios estructurales han proporcionado información relevante para emprender un posterior análisis funcional de PipX como coactivador de genes dependientes de NtcA. Puesto que las estructuras determinadas para los complejos PII-PipX y PipX-NtcA sugieren posibles interacciones adicionales de PipX con otras proteínas, hemos hecho también una exploración inicial de esta posibilidad. Por último, y siguiendo el principio de que los genes del mismo operón deben tener funciones relacionadas, hemos iniciado una caracterización preliminar de la orf Synpcc7942_2060, situada inmediatamente aguas abajo de pipX.