Terapia oxidativa antitumoral en líneas celulares humanas de cáncer de mama

Resumen

INTRODUCCION Hay suficientes evidencias para sugerir que las células cancerosas, comparándolas con células normales, presentan un mayor nivel de estrés oxidativo intrínseco, asociado con transformación oncogénica, mayor actividad metabólica y disfunción mitocondrial. La creciente generación de ROS en las células cancerígenas actúa como fuente endógena de productos que dañan el DNA, promoviendo inestabilidad genética y desarrollando resistencia a ciertas drogas. También se ha sugerido que las células tumorales presentan menor número de mitocondrias que las células sanas, siendo más susceptibles al daño mitocondrial. Un mal funcionamiento de las mitocondrias también altera la respuesta apoptótica de las células tumorales frente a agentes anticancerígenos. Además, la mayoría de las células tumorales poseen con frecuencia niveles muy bajos de enzimas antioxidantes, como catalasa, superóxido dismutasa y glutatione peroxidasa, conocidas por su papel protector frente a los ROS en células normales. La falta de un sistema defensivo antioxidante apropiado convierte a las células cancerosas muy vulnerables al estrés oxidativo. Es sabido que el estrés oxidativo alto y el daño mitocondrial inducen apoptosis por la ruta intrínseca. Existe una nueva estrategia anticancerígena llamada ¿terapia oxidativa¿ basada en la producción de niveles altos de estrés oxidativo, ya sea aumentando la producción de ROS o disminuyendo las defensas antioxidantes. Datos aportados por nuestro grupo demuestran que la amitriptilina (Amit), un antidepresivo tricíclico, produce sobre células en cultivo un aumento de ROS además de una disminución de las defensas antioxidantes intracelulares de manera significativa, provocando muerte celular por apoptosis. En esta línea de investigación sugerimos a la Amit como nueva droga antitumoral dentro de esta estrategia terapéutica. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es Aplicar la terapia oxidativa antitumoral en líneas celulares humanas de cáncer de mama utilizando amitriptilina de forma independiente y en combinación con un quimioterapéutico de uso común en oncología. Para abarcar el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos parciales: 1. Estudiar los efectos citotóxicos de la amitriptilina sobre la viabilidad, estado de estrés oxidativo, maquinaria de defensa antioxidante y daño en la cadena respiratoria mitocondrial y ADN en diferentes líneas celulares humanas de cáncer de mama. 2. Estudiar los efectos citotóxicos del tratamiento combinado de amitriptilina con CPT sobre los mismos parámetros del objetivo anterior. 3. Realizar un análisis comparativo del nivel de estrés oxidativo y citotoxicidad provocada por la amitriptilina en varias líneas celulares humanas de cáncer de mama versus línea celular de mama no tumoral. 4. Estudiar el efecto del tratamiento combinado con amitriptilina y CPT en varias líneas celulares humanas de cáncer de mama versus línea celular de mama no tumoral. 5. Analizar la idoneidad de la terapia oxidativa antitumoral mediante el uso de amitriptilina, independiente o en combinación con CPT, en las diferentes líneas celulares de cáncer de mama elegidas según sus características moleculares. RESULTADOS Y DISCUSION Como parte central de este trabajo de investigación nos hemos planteado estudiar la relación entre estrés oxidativo causado por la amitriptilina y su combinación con un fármaco quimioterapéutico de uso común en oncología en líneas celulares humanas de la mama, tumorales y no tumorales, sugiriendo al antidepresivo amitriptilina como un nuevo agente antitumoral. La amitriptilina es un antidepresivo tricíclico usualmente prescrito para pacientes que experimentan enfermedades neurológicas e inflamatorias como fibromialgia, síndrome de fatiga crónica, migraña, síndrome del intestino irritable, y dolor facial atípico. La mayoría de los fármacos antineoplásicos que se han usado clínicamente en pacientes con cáncer son agentes antiproliferativos que preferentemente van a matar células en división, principalmente actuando a nivel de síntesis, replicación o procesamiento del ADN. Además, hay tumores con desarrollo lento porque tiene muy reducida su capacidad de división, teniendo que buscar alternativas terapéuticas al uso de estos fármacos. El alto nivel de estrés oxidativo intrínseco de las células neoplásicas es una característica que puede ser explorada terapéuticamente, probando drogas que generen suficientes radicales libres como para producir lesiones celulares irreversibles. Una disminución de los antioxidantes por parte de estas drogas también ayudaría a incrementar el efecto citotóxico que provocan los niveles altos de ROS. A continuación se exponen y se discuten de forma resumida los resultados obtenidos en este estudio. A.- Efecto citotóxico de la amitriptilina de forma independiente en líneas celulares humanas de la mama: La línea no tumoral de mama (MCF-10A) presentó una mayor capacidad de resistencia a las elevadas concentraciones crecientes de AMIT trabajadas en el ensayo de viabilidad. Dichas células disminuyeron en número, viendo afectada su población de forma considerable a partir de 100 AM, pero a concentraciones mayores, resistieron siempre con un pequeño porcentaje de supervivientes. Esto nos lleva a pensar que pueden que tengan bajos niveles de ROS celulares, de tal forma que, necesiten mayores concentraciones de AMIT para que los cultivos mueran por completo después del creciente ¿shock oxidativo¿ al que los hemos expuesto. Si observamos los niveles de ROS, vemos como presentan bajos valores de los mismos (comparándolos, con los observados en las líneas tumorales). Los resultados obtenidos demuestran que tras el tratamiento con AMIT baja la expresión relativa de diversos antioxidantes tales como la MnSOD mitocondrial, catalasa y glutatión-S-reductasa. Esto está en consonancia con trabajos previos realizados por nuestro grupo. Por otro lado, resultados opuestos hemos encontrado en la expresión relativa de la HO-1, la cual ha aumentado de forma considerable tras tratar con AMIT. Se ha estudiado como la expresión de HO-1 bloquea la muerte celular inducida por deprivación sérica, etopóxido y estaurosporina, produciéndose un salida del hierro a través de un incremento de la actividad de la bomba de hierro, evidenciándose un rol de esta enzima en la modulación de los niveles intracelulares del hierro y en la regulación de la viabilidad celular. Esto explicaría, al menos en parte, la resistencia que tiene la línea celular no tumoral a concentraciones crecientes de AMIT, llegando a concentraciones elevadas y donde la viabilidad se reducida hasta el 15%, pero no valores por debajo de éste. En lo que respecta al daño causado por la AMIT en la cadena de transporte respiratorio mitocondrial, vimos como disminuyeron las cantidades de los complejos I y III. Estos complejos de la cadena respiratoria mitocondrial son los responsables de la formación de radical superóxido, y cuando la cantidad de dichas proteínas de membrana se ve reducida, la célula produce radicales superóxido. Como hemos demostrado en otros trabajos de nuestro grupo investigacion en diferentes líneas, este descenso de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial provoca disfunción mitocondrial y aumento de los ROS. En la línea celular ¿normal¿ de mama (MCF-10A), también hemos observado un aumento de ROS tras el tratamiento con AMIT. Un aumento de ROS puede producir alteraciones en el ADN. Una de estas alteraciones suele ser la formación de 8-oxo-guanina, siendo la 8-oxoguanina ADN glicosilasa humana (hOgg-1) la enzima encargada de reparar estos daños en el ADN evitando de esta forma consecuencias criticas para la integridad del genoma. Las MCF- 10A aumentan la cantidad de proteína Ogg-1 tras el tratamiento con AMIT, quizás en un intento por reparar los daños causados por el incremento de ROS. Las MCF-7 parece ser la más sensible al tratamiento con AMIT, donde a 20 AM su población se reduce al aproximadamente 40%, tienen unos niveles de ROS de per se bastante elevados ya que las células tumorales tienen un mayor estrés oxidativo que las células no tumorales. Esto es debido a que tiene más acelerado su metabolismo para poder mantener sus características cancerosas. Incluso son las células que presentan la más destacable elevación de ROS intracelulares tras el tratamiento con AMIT. Esta elevación puede tener dos consecuencias: por un lado, para contrarrestar ese desequilibrio oxidativo, elevan la expresión de algunos antioxidantes tales como la MnSOD, CAT y GSR. Como hemos observado en este esudio, lo contrario sucede para el caso de la HO-1, que baja su expresión tras el tratamiento con AMIT. Este resultado puede explicar la frágil viabilidad. Y por otro lado una disminución de los complejos I y III de la membrana interna mitocondrial. Todo esto acabó en un daño en el ADN, debido a que los niveles de Ogg-1 fueron incrementados. Las MDA-MB-231 tratadas con AMIT apenas mostraban cambios en la viabilidad a las concentraciones ensayadas y presentaron un elevado nivel de ROS, los cuales por un lado, no son equilibrado por la maquinaria antioxidante, presentando una descenso, por lo general, de los antioxidantes de estudio, salvo para la HO-1 (proporcionándole esta enzima a la línea, las mismas características antiapoptóticas que a las MCF-10A) y por otro lado, el descenso de complejos I y III de la cadena mitocondrial favorece este incremento de ROS. El ADN también se vio dañado tras el tratamiento. Por último las BT-474, una susceptibilidad al tratamiento menor que las MCF-7 pero algo mayor que las MDA-MB-231, según reflejan los ensayos de viabilidad, presentando un nivel de ROS bajos y un leve incremento tras tratar con AMIT pero por el contrario una exagerada expresión de MnSOD tras el leve incremento de radicales superóxido. Los niveles de HO-1 son concordantes con la escasa resistencia a levadas concentraciones de AMIT presentadas por esta línea. También vimos muy afectada la membrana respiratoria mitocondrial, al ser la línea que más reducida tenia la cantidad de complejo I y III tras el tratamiento con AMIT. Tras los estudio de viabilidad, detectamos que la línea celular más sensible a la AMIT fue la MCF-7, mostrando una bajada de la viabilidad muy significativa a 20 AM. Esta concentración fue la que se tomó para los ensayos de citotoxicidad y para los de la combinación con CPT La formación de los ROS es un efecto secundario normal de la cadena de transporte electrónico, pero el porcentaje de electrones transportados que se pierden como radicales libres asciende de forma peligrosa cuando la cadena respiratoria sufre algún tipo de disfunción, generando en el organismo una situación de estrés oxidativo. La disminución de la cantidad del complejo I y III en las células tratadas con AMIT sugieren de disfunción mitocondrial, que estaría induciendo la formación de más ROS, que junto con el descenso de antioxidantes, estarían contribuyendo a un aumento de los niveles de estrés oxidativo y explicando el descenso de la población celular debida a la activación de la apoptosis por la vía intrínseca. Nuestros resultados indican que entre los elevados niveles de ROS detectados, una alta concentración se debía principalmente a la presencia de radical superoxido, como demuestra los ensayos con MitoSOXTM, oxidado por el radical superoxido. Este radical libre es relativamente poco reactivo pero potencialmente toxico como se ha visto en la literatura, pudiendo servir como iniciador para la formación de otros tipos de radicales libres. El estado iónico del O2 ¿- lo hace ser una molécula bastante reactiva con las diferentes moléculas intracelulares causando una modificación oxidativa directa en las cadenas laterales de los aminoácidos. Por tanto, el aumento de radical O2 ¿- podría provocar dos reacciones: una, el inicio de la cascada apoptótica y otro, interacciones con estructuras intracelulares tales como la red de microtúbulos. Se ha visto como esta red de microtúbulos es necesaria para la correcta ejecución de la apoptosis. Esta alteración en las propiedades químicas del citoplasma podría derivar finalmente en una necrosis secundaria como consecuencia del fallo apoptótico. En este sentido, en las células tumorales tratadas con amitriptilina se observó una significativa disminución en la expresión de proteínas del complejo I y III, manifestando de esta forma los daños provocados por este fármaco en la cadena respiratoria, además de, como ya se ha comentado, una inducción de la permeabilización mitocondrial. Los resultados de nuestro estudio están en consonancia con los obtenidos con la clomipramina, otro antidepresivo tricíclico, que ha demostrado bloquear el consumo de oxígeno celular en levaduras y fibroblastos humanos. Varios estudios demuestran que la clorimipramina es efectiva contra las células de leucemia humana, las células del cáncer renal. Su mecanismo de acción consiste en iniciar la apoptosis por la vía intrínseca caspasa-3-dependiente a través de la inhibición del complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial. La membrana mitocondrial interna está constituida por varios elementos, entre ellos los complejos I y III, componentes esenciales para transporte de electrones de la cadena respiratoria. La reducción de los niveles de estos complejos observada en las células tumorales tratadas con amitriptilina podría inducir una alteración en el flujo de electrones mitocondrial, generando el aumento de los niveles de ROS detectado en este estudio. Para contrarrestar el daño que los ROS pueden producir a las biomoléculas, los organismos aeróbicos han desarrollado un sistema de defensa antioxidante. Cuando la capacidad de los mecanismos antioxidantes es superada por las agresiones oxidativas, nos encontramos ante un fenómeno de estrés oxidativo, capaz de provocar alteraciones a distintas moléculas y orgánulos celulares. Cuando las mitocondrias se ven afectadas, pueden promover la apoptosis por activación de las caspasas. La inhibición del sistema antioxidante por la oxidación reduce a su vez la capacidad celular de eliminar radicales libres tales como el radical O2 ¿- , aumentando aun más el estrés oxidativo. En general, el aumento de la producción de ROS provoca, como respuesta, un aumento de las actividades de los antioxidantes. A veces, sin embargo, en virtud de la alta tasa de entrada de ROS, la inactivación enzimática prevalece, lo que lleva a la reducción de actividad de las enzimas antioxidantes y al proceso de daño oxidativo. Por otra parte, es frecuente encontrar niveles bajos de enzimas antioxidantes en las células tumorales, como la MnSOD, CAT y GSR que se sabe que desempeñan una función de protección contra radicales libres. En este estudio, hemos encontrado una disminución de la expresión de dichas enzimas antioxidantes. Resumiendo, nuestros resultados indican que la amitriptilina altera la cadena respiratoria, provocando exceso de ROS y daño en el ADN. Además, hemos observado una disminución de algunos antioxidantes, esta alteraciones provocan un aumento del estrés oxidativo por encima del umbral letal soportado por las células, especialmente las MCF-7, cuyo nivel basal de estrés oxidativo era muy suoerior al de las células no tumorales MCF-10A. B.- Efectos citotóxicos del tratamiento combinado de amitriptilina con CPT: Tras combinar la AMIT con CPT en cultivos de MCF-10A, observamos un aumento de los niveles de radical superoxido intracelular y un efecto en el sistema antioxidante aun más acusado. Por otro lado no hubo tanto daño ni en la cadena respiratoria mitocondrial, aumentando incluso los niveles de complejo III, ni en el ADN, con aumento menor de la cantidad de Ogg-1. Las MCF-7 presentaron unas asombrosas cantidades de ROS intracelulares, una débil maquinaria de defensa antioxidante y grave daño en la cadena respiratoria y material genético. Las MDA-MB-231 mostraron superiores cantidades de radicales libres en la combinación presentando también un descenso de la MnSOD, CAT y GSR y mayor aumento en la expresión de HO-1. La combinación AMIT y CPT causó un daño más evidente tanto en la cadena respiratoria como en el ADN. Sin embargo, a nivel de estudio de los ROS, en las BT-474 apenas son apreciables sus niveles con el método de detección usado y el sistema antioxidante presenta niveles de expresión similares a las condiciones con AMIT solamente. El daño en la cadena de transporte electrónico no parece variar demasiado y el daño en el material genético es menor. C.- Nivel de estrés oxidativo y citotoxicidad provocada por la amitriptilina en líneas celulares humanas de cáncer de mama versus línea celular de mama no tumoral: En condiciones normales hemos observado un nivel de ROS considerable en las MCF-7 y MDA-MB-231 que en las MCF-10A y BT-474, esta última presentó, contra todo pronóstico, unos niveles de ROS muy bajos. La MnSOD en las MCF-7 presentó valores muy superiores a las MCF-10A teniendo las MDA-MB-231 y las BT-474 una expresión muy por debajo de los valores considerados normales. Lo contrario sucedió para la CAT, donde estas dos líneas tuvieron los niveles más elevados. La GSR tenéa elevados sus niveles e expresión en la línea BT-474 por encima de las MCF-10A, y las otras dos líneas tumorales. La expresión de HO-1 aumentó de forma creciente en MCF- 7, BT-474 y MDA-MB-231, respectivamente. Encontramos altos niveles de ROS en las líneas MCF-7 y MDA.MB-231 en presencia de AMIT, bajos en las MCF-10A y apenas apreciables en las BT-474. Sin embargo la línea no tumoral tiene una alta expresión de complejos I y III que se ven ligeramente descendidos tras tratar con AMIT. Datos similares hemos contemplado para las MDA-MB-231 presuponiendo que la AMIT no causa tanto daño en la cadena respiratoria mitocondrial como en las MCF-7 y BT-474. La MnSOD es la que sufre un mayor incremento en la línea MCF-7. Sin embargo en las demás líneas tumorales no parecen verse modificada su expresión tras el tratamiento. La expresión de CAT en líneas MDA-MB-231 presentó un incremento y en las BT-474, un descenso tras el tratamiento. En esta ultimas, fueron las únicas que incrementaron la expresión de GSR. Finalmente, en lo que respecta a la HO-1, fueron las MDA-MB-231 y las BT-474 las líneas que sufrieron un descenso en la expresión de dicha enzima antioxidante. En lo que se refiere al daño en el ADN, encontramos resultados uniformes en todas las líneas celulares, demostrando que el tratamiento con AMIT daña de forma evidente el material genético de la célula. Las células tumorales tienen un mayor estrés oxidativo que las células no tumorales debido a que tiene más acelerado su metabolismo para poder dividirse (Behrend, 2003). En este trabajo hemos visto como las células tumorales no pueden sobrevivir a concentraciones superiores a 100 AM (excepto las MDA-MB-231), quizás porque tengan tan elevados sus niveles intracelulares de ROS, que con poco que incrementemos la concentración de AMIT, observamos consecuencias catastróficas para el cultivo. Caso peculiar el que sucede en la línea MDA-MB-231, la cual a 100 AM de AMIT, presenta aproximadamente el tripe de supervivencia que la línea no tumoral, detalle que nos sorprendió. Las MCF-7 es la línea que parece ser la más sensible al tratamiento con AMIT, donde a 20 AM su población se reduce al aproximadamente 40% (las BT-474 al 77% y las MDA-MB-231 al 97%) De todas las líneas tumorales de estudio, las que mayor estrés oxidativo presentaron de per se fueron las MCF-7 y las MDA-MB-231. Las BT-474 manifestaron bajos niveles de ROS. Lo que si se observó fue como la AMIT hacia aumentar los niveles de ROS intracelulares, sobre todo las MCF-7. Para defenderse de este ataque oxidativo, las MCF-7 presentaron un incremento en la expresión de antioxidantes tales como MnSOD, CAT y GSR. No fue así para el caso de la HO-1, bajando de forma significativa su expresión en las MCF-7. D.- Efecto del tratamiento combinado con amitriptilina y CPT en varias líneas celulares humanas de cáncer de mama versus línea celular de mama no tumoral: En las MCF-10A, obtuvimos un mayor nivel de ROS con el tratamiento combinado, niveles que para nada estimularon la expresión de los antioxidantes, donde paradójicamente, estos vieron aún más disminuida su expresión, excepto la HO-1 (alta resistencia de las MCF-10A a la apoptosis en los ensayos de viabilidad. Encontramos, menos daño en la cadena respiratoria mitocondrial y en el material genético. Las MCF-7 tuvieron una reacción muy favorable con el tratamiento combinado, disminuyendo su población e incrementando los niveles de ROS. La maquinaria antioxidante quedó altamente dañada, apreciando un descenso en la expresión tras el tratamiento. El daño en la cadena respiratoria y en el ADN fue elevado. Las MDA-MB-231 también presentaron altos niveles de ROS y una muy baja expresión en algunos de sus antioxidantes, como por ejemplo la MnSOD y la GSR. Algo más de expresión tienen de CAT y HO-1 pero con el tratamiento combinado disminuyen drásticamente. Todo ello condujo a un mayor daño en la molécula de ADN y cadena respiratoria mitocondrial. Finalmente, las BT-474, tras detectar en ellas una baja cantidad de ROS intracelulares vimos como presentan muy bajas cantidades de MnSOD, apenas apreciables, debido a los niveles de radical superóxido detectado. Sin embargo, el resto de antioxidantes sí que nos revelaron un descenso más que considerable en la su expresión tras el tratamiento combinado. El daño en la cadena de transporte electrónico y en el ADN también fue evidente en esta línea tumoral, pero más bajos que en la línea no tumoral. En este trabajo, los efectos de la amitriptilina se compararon con los efectos de la combinación de dicho antidepresivo junto con un fármaco antitumoral utilizado con frecuencia en quimioterapia, la camptotecina (CPT). Después de 24 horas de tratamiento con amitriptilina y CPT, los resultados obtenidos mostraron un incremento de ROS y varios signos de daño oxidativo como la disminución de proteínas del complejo III y daños en el material genético; lo que podría llevar a una menor capacidad de producir ATP. Este incremento de ROS producido por la combinación de ambos fármacos fue muy significativa en comparación con el tratamiendo con amitriptilina sola, salvo para la línea BT-474. Esto nos hace pensar que el daño oxidativo inducido por la combinación depende del tipo tumoral. En cuanto a la viabilidad, se observó que la combinación mostró mayor número de células muertas en células tumorales de la mama. En la determinación de antioxidantes se observó un descenso en la expresión de MnSOD, CAT, GSR y HO-1, quedando más que afectado el sistema de defensa antioxidante frente al daño oxidativo. Después de observar los datos del daño en la cadena respiratoria mitocondrial, ADN, aumento de ROS y alteración del mecanismo antioxidante provocados por la combinacion en comparación con la AMIT, nuestros resultados apuntan a las MCF-7 como la línea tumoral de mama más afectada, depues las MDA-MB-231 y, por último, las BT-474. Se ha descrito que muchas células tumorales presentan una reducción de antioxidantes, que se sabe que desempeñan una función de protección contra los ROS en las células normales. La falta de una adecuada defensa antioxidante hace que las células tumorales sean más vulnerables al estrés oxidativo. Entre estas enzimas destaca la SOD, que cataliza la reacción de destrucción del superóxido mediante su transformación en peróxido de hidrógeno, el cual puede ser destruido, a su vez, por las actividades de la catalasa, que desempeña un papel importante en la defensa celular a través de la conversión de peróxido de hidrógeno a H2O. En este estudio, la amitriptilina provocó una disminución significativa de varios antioxidantes (MnSOD, CAT, GSR y HO-1), afectando drásticamente a las defensas celulares. Los fármacos quimioterápicos usados en este estudio no provocaron ninguna disminución de estos antioxidantes, por el contrario ha dado lugar a un ligero aumento de estos antioxidantes. Estos resultados concuerdan con otros trabajos donde quedó demostrado que los fármacos quimioterápicos incrementaron los niveles de ciertos antioxidantes en líneas celulares cancerígenas, probablemente como un mecanismo de protección contra la generación de ROS. Por lo tanto, la combinación provoca un mayor daño oxidativo a las células cancerosas que la AMIT y el CPT por separados, actuando por dos mecanismos diferentes: por un lado, induciendo la producción de ROS, daño en la respiración mitocondrial y daño en el ADN, y por otro, disminuyendo significativamente los niveles de antioxidantes, lo que limita seriamente la reacción celular al estrés oxidativo inducido. E.- Idoneidad de la terapia oxidativa antitumoral mediante el uso de amitriptilina, en las diferentes líneas celulares de cáncer de mama elegidas según sus características moleculares. Los altos niveles de estrés oxidativo intrínseco de las células neoplásicas es una característica que debe ser explorada terapéuticamente, ensayando agentes quimioterápicos que ejerzan su efecto sobre las células cancerígenas induciendo la producción de radicales libres que conduzcan a lesiones celulares letales, y que la sobrecarga de ROS en las células neoplásicas pueda agotar su capacidad antioxidante. Fármacos que disminuyan la actividad antioxidante son también de gran interés para esta estrategia antitumoral. En este estudio se administró amitriptilina a varias líneas celulares humanas de cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-231 y BT-474) y una considerada no tumoral (MCF-10A). Las MCF-7 provienen de adenocarcinomas (AC) de mama y tienen un perfil molecular hormonodependiente (RE+, RPg+ y HER-2-) diferente a las MDAMB- 231 (RE-, RPg- y HER-2-), que también provienen de AC de mama. Este perfil las hace tener distintas sensibilidades al tratamiento con quimioterapéuticos, con lo cual, nos presenta una oportunidad para saber si la terapia oxidativa antitumoral, tanto de forma independiente como combinada con CPT, podría ser un tratamiento a tener en cuenta en futuras investigaciones. Caso aparte son las BT-474, que provienen de un carcinoma ductal invasivo hormonodependiente y expresan todos los marcadores moleculares anteriormente citados. Las MCF-10A provienen de fibroblastos transformados de la mama. Existen varios subgrupos moleculares en los que se pueden clasificarse las líneas tumorales trabajadas: subgrupo Luminal A (MCF-7) y Luminal B (BT-474) siendo ambos tipos productores de receptores de estrógenos y por tanto susceptibles a hormonoterapia y el subgrupo claudine-low (MDA-MB-231). Esta última línea celular tiene una unión débil entre ellas, proporcionándoles características invasivas in vitro y, por tanto, teniendo características que le hacen tener un mal pronóstico en tratamientos in vivo. La AMIT y el CPT aumenta las cantidades de peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo en líneas tumorales de mama, a ello se le suma el estrés oxidativo inherente de estas células. Tumores de mama agresivos son capaces de adaptarse a este ambiente altamente oxidativo, manteniendo el daño oxidativo por debajo de los valores letales contribuyendo al crecimiento, angiogénesis y metástasis tumoral. Si a ello le añadimos un antidepresivo tricíclico como la AMIT aumenta aún más los niveles de radicales libres y por muy adaptadas que estén al ambiente oxidativo, puede acabar muriendo por apoptosis nos hace pensar en la terapia oxidativa como una alternativa real a los tratamientos existentes hasta el momento, de eficacias variables según el tipo de tumor. Hay que reseñar, que aunque la línea MCF-10A sean consideradas ¿normales¿ hay algunas diferencias. Las MCF-10A aunque poseen un cariotipo estable y casi diploide son citogeneticamente inestables (Soule, H.D., 1990). En concreto, estas células albergan anomalías genéticas comúnmente asociadas con el cultivo in vitro en las células epiteliales mamarias, incluyendo delección del locus que contiene p16 y p14ARF, así como la amplificación de MYC (Elenbaas, B., 2001; Stampfer, M.R., 2000). Estos cambios pueden cooperar fenotípicamente con la introducción de oncogenes adicionales. En particular, las células MCF-10A expresan p53 de tipo salvaje (Merlo, G.R., 1995). Hay trabajos en los que se sugiere que la inmortalización de células epiteliales mamarias humanas provoca un sobrecrecimiento de células epiteliales basales mamarias (DiRenzo, J., 2002). Aunque se cree que la mayoría de los canceres mamarios humanos provienen de células epiteliales luminales, hay también un subgrupo que provienen de las comentadas células epiteliales basales (Sorlie, T., 2001; Perou, C.M., 2000) La línea celular que mejor respondió a la terapia oxidativa con AMIT, sola o en combinación con CPT, fue la MCF-7. Las MDA-MB-231 no respondieron a nuestra terapia oxidativa como lo hicieron las MCF-7 lo que nos hace pensar que, quizás, las características moleculares son importantes a la hora de elegir una estirpe tumoral para un tratamiento oxidativo antitumoral. Para futuras investigaciones con modelos animales habría que empezar probando con tumores de mama de características moleculares similares a las MCF-7. No obstante todavía se requieren más estudios in vitro, con estas y otras líneas celulares de cáncer de mama de características semejantes a las MCF-7.