Aplicación de un modelo celular para la evaluación de la citotoxicidad de compuestos químicos

Laburpena

El medio ambiente se encuentra sometido a una creciente presión antropogénica, debida en gran medida a la liberación de compuestos químicos a nuestro entorno. De este modo, cada vez es mayor el número de sustancias de diversa índole que aparecen como contaminantes en sistemas naturales. Dos de los grupos que más preocupación vienen generando en los últimos años son los compuestos orgánicos persistentes (COPs) y los fármacos y productos de consumo e higiene personal (PPCPs), que se encuentran presentes en aguas superficiales de todo el mundo. La exposición masiva a estos compuestos no sólo del medio ambiente, sino de las poblaciones humanas en general, suscitó la necesidad de revisar las normativas vigentes. Este proceso culminó en 2007 con la entrada en vigor de una nueva legislación en el ámbito de la Unión Europea, conocida como REACH y relativa al registro, evaluación, autorización y restricción de las sustancias y preparados químicos. En ella, la obligación de evaluar el riesgo tóxico de los mismos es responsabilidad de las empresas productoras o importadoras y no de las instituciones públicas. Además, entre sus principales objetivos se encuentra el fomento de los ensayos alternativos a la experimentación animal, lo que supone una ocasión única para el desarrollo de nuevas estrategias metodológicas para la evaluación toxicológica de todo tipo de productos químicos. Los cultivos celulares resultan de particular interés entre las distintas aplicaciones experimentales disponibles, contando con una amplia variedad de metodologías aplicables a la evaluación toxicológica. A pesar de que los estudios de citotoxicidad son una aproximación reduccionista a los ensayos de toxicidad aguda in vivo, suponen el mejor grado de compromiso entre la obtención de información relevante sobre el mecanismo de acción tóxica y el empleo de métodos alternativos a la experimentación animal. En esta línea, la presente tesis propone una estrategia celular de ensayos integrada que analiza parámetros complementarios de proliferación, viabilidad y morfología, para conocer el grado de toxicidad, mecanismo de acción y respuesta celular de los compuestos estudiados, aproximando la Biología celular a la Toxicología mediante sistemas in vitro sencillos y fácilmente reproducibles. Parta evaluar la validez del sistema propuesto, se han seleccionado seis compuestos de distinta naturaleza química pero que comparten un punto común de interacción con las células: la capacidad de interferir con las mitocondrias. Se trata de los PPCPs butil hidroxianisol y dibucaína; los plastificantes industriales ácido perfluoroctanoico y diwrilhexil ftalato; y los biocidas pentaclorofenol y rotenona. Además, el análisis se ha llevado a cabo en paralelo en tres líneas celulares de distinto origen (Vero, HeLa y 3T3), con la intención de comparar su aplicabilidad y el grado de sensibilidad ante la presencia de las sustancias seleccionadas. Las tres líneas celulares son apropiadas para desarrollar el modelo propuesto, si bien con las células Vero, fibroblastos de riñón de mono verde africano, se consiguió el grado de sensibilidad más alto. Esta circunstancia, junto con otras características propias de esta línea celular, nos llevaron a seleccionarla como modelo para desarrollar los protocolos necesarios para determinar en detalla el mecanismo de acción tóxica de cada uno de los compuestos. Los resultados así obtenidos permiten establecer las dianas celulares específicas para las sustancias estudiadas que, sorprendentemente, no se reducen exclusivamente a la disfunción mitocondrial. Dado que el modelo analiza de manera sistemática las principales dianas celulares susceptibles de sufrir alteraciones ante la acción de xenobióticos, nuestro estudio establece el mecanismo de acción tóxico para cada uno de los compuestos estudiados, resaltando la importancia de la realización de pruebas morfológicas. De este modo, sólo en el caso del ácido perflurooctanoico la mitocondría se mantiene como única diana intracelular responsable del efecto tóxico observado, mientras que en la exposición a butil hidroxianisol se detecta también un importante efecto sobre la estabilidad de las membranas. Por el contrario, las dianas celulares preferentes de la dibucaína y el pentaclorofenol son los lisosomas; mientras que después del tratamiento con rotenona se altera el citoesqueleto y el dietilhexil ftalato afecta a distintos procesos celulares. En conjunto, podemos concluir que mediante el modelo celular propuesto hemos podido establecer un mecanismo de acción concreto para cada uno de los compuestos evaluados, independientemente de su naturaleza química. El buen funcionamiento del modelo queda patente al haber sido capaz de identificar alteraciones y efectos nocivos muy distintos, dado el carácter tan diverso de los mecanismos de acción tóxica subyacentes a los compuestos seleccionados.