Microcistinaspresencia, determinación y estudios toxicológicos

Zusammenfassung

Las Microcistinas (MCs) son toxinas peptídicas de bajo peso molecular, producidas por diferentes especies de algas cianofíceas (blue-green algae), fundamentalmente de los géneros Mycrocystis, Anabaena, Oscillatoria, y Nostoc que crecen a veces de forma anormal en aguas superficiales originando intoxicaciones tanto en animales como en humanos, a veces incluso fatales, por lo que están consideradas como un problema ambiental, ecotoxicológico (Christoffersen, 1996) y principalmente sanitario (Chorus y Bartram, 1999). Geográficamente, las floraciones de estas algas se distribuyen ampliamente en las aguas superficiales, y la aparición de las mismas en determinadas condiciones ambientales (Carmichael, 1994) es ubicua, de forma que hoy día se reconoce a escala mundial que en la mayoría de los países se presentan estos crecimientos anormales (Sivonen, 1996; Fastner y col. 1999). Se han identificado también en ambientes marinos aunque no está claro cuál es el organismos productor de las toxinas (Codd, 1998). Las cianobacterias han sido objeto de atención en el campo de la biotecnología, ya que pueden emplearse como suplementos en la alimentación debido a que algunas cepas presentan un alto contenido en proteínas, vitaminas y pigmentos, siendo además fuente de sustancias de interés farmacéutico, como antibióticos (Falcha y col. 1995). Las últimas investigaciones se dirigen asimismo hacia el estudio de la producción y liberación de toxinas en aguas dulces y salobres con efectos sobre la salud para el ganado y el hombre. Tras la aparición y detección de una floración de cianobacterias en la superficie acuática, debemos asumir de antemano la posible toxicidad de la misma, aunque puede que no todas las especies presentes, o incluso no todas las estirpes de una misma especie, sean las responsables de la producción de toxinas 8Watanabe, 1996). Para la identificación de la o las especies/estirpes productoras se requiere el aislamiento de cada una de las especies identificadas al microscopio y la obtención de un cultivo axénico y monoalgasl, observándose el hecho de que la máxima producción tóxica y el mayor crecimiento del cultivo no son proporcionales y no se dan en las mismas condiciones. Por tanto, el estudio del perfil toxicológico de las especies involucradas en una floración de cianobacterias es esencial para la evaluación del riesgo tóxico a que puede estar expuesta la población. Los factores que más influyen en el crecimiento de las cianobacterias y en la producción de toxinas son: temperatura (18 � 25º C), luz, nutrientes (aguas eutróficas), salinidad, pH y presencia de metales de forma que existe una variabilidad en la producción de toxinas en una misma columna de agua día a día, e incluso en un mismo día, dependiendo de las condiciones del viento o de las diferencias en la composición de especies constituyentes. Además, los máximos de concentración de MCs no siempre coinciden con una elevada biomasa de cianobacterias. La toxicidad por unidad de peso seco varia tanto semanal como anualmente, por lo que se cree que a veces hay factores aún desconocidos que controlan la producción de toxinas (Christoffersen, 1996a). Todo lo cual justifica la necesidad de llevar a cabo estudios de monitorización en aquellas zonas donde se detecten floraciones tóxicas. Estructuralmente las MCs se caracterizan por una estructura cíclica, formada por siete aminoácidos, y actualmente hay identificadas más de 60 tipos diferentes (Harada, 1996), que varían en las sustituciones de L-aminoácidos distintos en determinadas posiciones, desmetilaciones de otros aminoácidos (Sivonen, 1998; Codd uy col. 1999a), siendo MC-LR, MC-RR y MC-YR las más estudiadas, y no conociéndose aún el origen de la existencia de tantas variantes de toxinas (Lawton y Edwards, 2001). Son muy estables y resistentes a la hidrólisis química u oxidación a pH casi neutro, y para su degradación completa es necesario un tratamiento en condiciones fuertemente ácidas, como HCl 6 N y ácido trifluoracético (TFA) (Harada y col. 1996); las investigaciones sobre su hidrólisis enzimática son escasas y los resultados son contradictorios (Harada, 1996; Takenaka, 1998), siendo este aspecto fundamental ya que la hidrólisis en el estómago o intestino de un tóxico puede conducir a la formación de metabolitos con diferente toxicidad, o bien, la diferente toxicidad en función de la vía de administración puede deberse a ruptura del compuesto de partida por acción de enzimas del tracto gastrointestinas (GI) (Klaassen, 2001), siendo necesario dilucidar la extensión de la hidrólisis y la posible degradación de MCs en el tracto GI. Las MCs al igual que nodularinas resultan ser hepatotóxicas en humanos (Falconer, 1999), aunque también dan lugar a alteraciones gastrointestinales (Carmichel, 1996a), reacciones alérgicas o irritación (Codd y col. 1999a), y síntomas parecidos a la neumonía (Bell y Codd, 1994). Pero su principal interés radica en los efectos tóxicos crónicos como consecuencia de una exposición prolongada, ya que se sospecha que puedan ser promotores de tumores, lo que unido a su actividad genotóxica (Ding y col. 1999) hace que diversos estudios epidemiológicos sugieran una mayor incidencia de cáncer de hígado en zonas cuyas aguas de bebida están contaminadas por MCs (Yu, 1995), advirtiéndose la necesidad de conocer otras posibles fuentes de exposición humana, tales como alimentos. La exposición a cianotoxinas puede ocurrir por diferentes vías, como la dérmica, inhalatoria, oral e intravenosa. Por vía oral, se produce por el consumo de agua contaminada con células de cianobacterias tóxicas y por el consumo de animales que han ingerido dichas cianobacterias y acumulan sus toxinas, como peces (Williams y col. 1997a; de Magalhaes y col. 2001) y moluscos (Watanabe y col. 1997; Williams y col. 1997b; Vasconcelos, 19999, o de vegetales regados con aguas contaminadas (McElhiney y col. 2001; Codd y col. 1999b). Las intoxicaciones severas afectan principalmente a los animales terrestees (Carmichael, 1996b), aves y peces (Bury y col. 1996; Zimba y col. 2001) que beben y viven en estas aguas, aunque algunas especies marinas, especialmente especies cultivadas en piscifactorías, también se han visto afectadas (Carmichael, 1996b). Las MCs son en general muy tóxicas por exposición aguda, oscilando la DL50 de MC-LR entre 25 y 150 µg/Kg en ratón por vía intraperitoneal (Kuiper-Goodman y col. 1999), siendo por vía oral menos tóxica, con una DL50 de 5000 µg/Kg (Fawell y col. 19999. La mayoría de los estudios existentes de toxicidad aguda revelan que son toxinas primariamente hepatóxicas en mamíferos y peces, encontrándose cambios en la estructura celular y alteraciones bioquímicas séricas, indicadoras del daño hepático (Fawell y col. 1999; Fischer y col. 20009. Estas toxinas se absorben fundamentalmente por un transportador específico de sales biliares localizado en el hepatocito (Runnegar y col. 1995). Se acepta que a nivel subcelular son inhibidores específicos de las protein fosfatasas tipo 1 (PP1) y tipo 2A (PP2A), las cuales regulan multitud de procesos biológicos. Esta inhibición causa un aumento en la fosforilación de las proteínas celulares que activa la cascada de las caspasas desencadenándose el proceso de apoptosis con la consecuente muerte celular (Yoshida y col. 1997; Hooser, 2000). Por otro lado, otros autores señalan daños celulares en el riñón (Nobre y col., 1999) e intestino (Ito y col. 19979 que podrían deberse igualmente a la presencia en estos tejidos del transportador de sales biliares responsable de la entrada de las MCs a la célula. Sin embargo, el mecanismo de acción tóxica de las MCs en estos órganos queda por dilucidar. Siendo más significativos los estudios de toxicidad de dosis repetidas (subcrónicos) y crónicos a largo plazo, por la propia fuente de exposición en humanos (aguas, alimentos), éstos sin embargo son muy escasos (Fawell y col. 1999; Heinze, 1999; Ueno y col. 1999), observándose principalmente daños celulares en hígado, y menores en riñón, intestino, corazón y glándulas adrenales. La escasez de estos estudios es debida fundamentalmente al elevado coste de los estándares y a la dificultad de obtención de las toxinas puras. En comparación con los mamíferos, existe menos información sobre la patología de las cianobacterias en peces. El efecto más definitivo de MCs sobre peces se ha observado en salmones procedentes del Atlántico, criados en cautividad en aguas de USA, produciendo una degeneración progresiva del hígado; dicha enfermedad, denominada �NetPen Liver Disease� (NPLD) ha producido importantes pérdidas económicas en la industria de cultivos marinos (Anderson y col. 1993). En algunas especies como carpa y trucha, las toxinas afectan no sólo al hígado sino también al riñón, corazón, branquias, piel, médula y sangre (Kotak y col. 1996a; Carbis y col. 1997; Fischer y Dietrich, 2000), existiendo intraespecie (Bury y col. 1997). En humanos no se han llegado a producir grandes fatalidades como resultado de la exposición a estas toxinas, salvo la intoxicación masiva en pacientes sometidos a diálisis ocurrida en 1996 en Brasil (Jochimsen y col. 1998; Pouria y col. 1998). Debido a que el agua utilizada para el tratamiento procedía de un depósito contaminado por cianobacterias, en la que se vieron afectados 116 de los 130 pacientes, registrándose una mortalidad elevada (60 murieron) por fallo hepático agudo. Los síntomas principales que presentan las personas que han estado en contacto con las toxinas, son: irritación en la piel y los ojos, episodios alérgicos, fatiga, mareos y gastroenteritis agudas. Cuando se ha producido la ingestión accidental de MCs (lisis celular por tratamiento con sulfato de cobre, etc.) los síntomas más usuales han sido: dolor abdominal, nauseas, vómitos, diarreas, tos seca, dolor de cabeza, neumonía atípica, elevación de enzimas hepáticas séricas como ?-glutamiltransferasa (Carmichael, 1996a), siendo los niños más susceptibles en comparación con el resto de la población (Falconer, 19999. Uno de los riesgos mayores derivados de la exposición crónica a bajas dosis de MCs resulta de su posible actividad carcinogénica (Fujili y col. 1996), confirmándose como promotoras de cáncer primario de hígado (PLC) en algunas áreas de China (Falconer y col. 1999a), aunque aún no han sido evaluadas definitivamente por la Agencia Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer, así mismo su capacidad mutagénica y teratogénica hace que sean necesarios estudios epidemiológicos en dicha dirección (Codd y col. 1999a). Los diversos estudios toxicológicos realizados hasta la actualidad han conducido al establecimiento de una Ingesta Diaria Tolerable (IDT) de 0,04 µg/Kg/día deMC-LR (al ser una de las toxinas más potentes, de las que existen más estudios toxicológicos y estándares comerciales para su identificación y cuantificación). La Organización Mundial de la Salud ha adoptado (WHO, 1998) un valor guía provisional de 1,0 µg/L de MC-LR en aguas de bebida, comprendiendo tanto las MCs intra como las extracelulares, aunque Ueno y col (1996) han propuesto un valor guía de 0,01 µg/L en casos de exposición crónica, por la posible correlación entre PLC y presencia de MCs en aguas. Si bien en diferentes países se establece la obligatoriedad de determinación de MCs en aguas, actualmente en España en la vigente Reglamentación técnico-sanitaria para el abastecimiento y control de la calidad de las aguas potables de consumo público (RD 1138/1990 de 14 de Septiembre) no se hace referencia a la determinación y control de MCs; sin embargo en el nuevo proyecto de reglamentación recogido en el anexo D, que hace referencia a las sustancias tóxicas, fija una concentración máxima admisible de MCs de 1 µg/L, pero sólo para el caso de aguas eutróficas. Aunque se han desarrollado diferentes métodos que permiten determinar las toxinas en aguas superficiales, aún no se ha aceptado ninguno como método estándar por las agencias oficiales de medio ambiente. Los métodos químicos como la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC), y la Electroforesis Capilar (Aguete y col. 2001), con diferentes detectores, nos permiten conocer la identidad y la cuantificación de las toxinas individuales producidas por diferentes cepas de cianobacterias (Carmichael, 1996b; Sirén y col. 1999). La determinación de MCs por métodos cromatográficos no está exenta de problemas y limitaciones, con una enorme variabilidad de posibilidades en su determinación (Meriluoto, 1997), existiendo resultados a veces contradictorios sobre todo en la etapa de extracción a partir del material celular; asimismo, son muy variados los procedimientos de limpieza y purificación de los extractos obtenidos (Lawton y Edwards, 2001). Recientemente, la introducción de la Cromatografía de Inmunoafinidad (ICA) está dando buenos resultados en la determinación de MCs en aguas, cultivos y pescados (Lawrence y Menard, 2001). En resumen, las investigaciones sobre toxinas de cianobacterias tóxicas, y en concreto de Microcistinas (MCs) son de la máxima actualidad, interesándonos en este trabajo el iniciar dicha línea de investigación en nuestro Departamento, comenzando los estudios de detección, identificación y cuantificación de cianobacterias presentes en floraciones potencialmente tóxicas en el Sudoeste de España, en concreto a lo largo del curso del río Guadiana, con el objetivo de intentar conocer la incidencia de dichas floraciones en esta zona, dada la falta de datos al respecto. La identificación y cuantificación de Microcistinas en las muestras de agua se realiza aplicando tanto métodos de screening o tamizado, como métodos confirmatorios. Dado que la producción de toxinas en una misma reserva de agua es variable y obedece a múltiples factores aún no totalmente dilucidados, nos proponemos contribuir al esclarecimiento de algunos de ellos, intentando relacionar los datos de monitorización obtenidos con diversos parámetros físico y químicos de la zona objeto de muestreo. También nos interesamos en estudiar el perfil toxicológico de las distintas especies involucradas en las floraciones detectadas, mediante el aislamiento y cultivo de las mismas. Los estudios de hidrólisis enzimática e influencia de las condiciones de pH gástrico e intestinal son imprescindibles a la hora de una correcta evaluación de la contribución que puede suponer el consumo de aguas contaminadas a la Ingesta Diaria Tolerable (IDT) de estas toxinas. Y por último hemos planteado un estudio de toxicidad agua en rata (vía intraperitoneal), con el objeto de desarrollar estudios toxicológicos que nos ayuden a ahondar aún más en los mecanismos de toxicidad de las MCs a nivel molecular y bioquímico, especialmente en intestino.