Aislamiento y caracterización de mutantes insercionales de Chlamydomonas insensibles a la señal positiva de nitrato

Résumé

La asimilación de nitrato es la ruta más importante para la adquisición de nitrógeno y está altamente regulada por la disponibilidad de nutrientes y factores ambientales. En el contexto de la regulación, el nitrato tiene un papel fundamental como señalizador positivo que permite la puesta en marcha y la expresión de una serie de genes esenciales de esta ruta. Sin embargo, en eucariotas fotosintéticos, no se conocen bien los mecanismos de cómo se siente el nitrato ni los genes reguladores implicados en este proceso. Con este objetivo se construyo una colección de mutantes insercionales (mutateca) de Chlamydomonas (1) donde todos los genes del alga estuvieran etiquetados y nos permitieran la búsqueda de genes involucrados en la asimilación de nitrato. La mutateca se ha construido a partir de la estirpe 704 de Chlamydomonas, que porta un gen reportero como sensor de nitrato/amonio (pNia1:Ars)(2), y como marcador seleccionable se ha utilizado el gen AphVIII (pSI104)(3) que confiere resistencia a paramomicina. De un total de 22.000 mutantes escrutados, 145 parecen estar relacionados con la ruta de asimilación de nitrato y concretamente 45 de ellos parecen afectados en la señalización positiva (NI, nitrato insensible). De estos mutantes NI, 5 tienen un fenotipo Nit-, una nula expresión del reportero, y todos presentan la inserción del marcador en el gen regulador Nit2 (en el cromosoma III) (4). El resto de los mutantes NI (40) tienen fenotipo Nit+ y presentan una baja actividad del reportero en respuesta a nitrato. Estos mutantes NI Nit+ se han clasificado a su vez en tres grupos, atendiendo a los niveles de actividad ARS en respuesta a nitrato: 1) muy insensibles a nitrato (ARS inferior al 25%), 2) moderadamente insensible a nitrato (ARS entre 25%-50%), y 3) nitrato sensibles (ARS entre 50%-75%). La mayoría de los mutantes NI contienen una copia del DNA etiqueta y se ha logrado identificar la región genómica afectada en el genoma de Chlamydomonas mediante la técnica RESDA-PCR (5) proponiéndose una gran cantidad de loci que podrían estar implicados en la señalización positiva por nitrato. Se eligieron varios mutantes para su estudio más detallado. Se determinaron diferentes actividades como NR, NiR, crecimiento en diferentes fuentes de nitrógeno y actividades de consumo de nitrato y nitrito en los mutantes NIs pertenecientes al primer grupo. Se caracterizó fisiológica y molecularmente más a fondo la mutación en dos mutantes NIs y así se ha podido dibujar un primer esquema de esta vía de señalización. Se concluyó que los genes para un posible inhibidor de ribonucleasa (5n2) y una proteína con dedos de zinc de unión a RNA (Znf) parecen tener un papel en la señalización positiva,