Caracterización molecular de las proteínas FIXK2 y NNRR que controlan la desnitrificación en bradyrhizobium diazoefficiens

Resum

El nitrógeno (N) es un componente esencial de los seres vivos y el elemento más abundante en la atmósfera (alrededor del 78%), sin embargo, el N biológicamente disponible es un factor limitante tanto para el crecimiento de los organismos vivos como para la producción de biomasa. Dentro del ciclo del N, la fijación biológica del nitrógeno molecular (N2) constituye el proceso más importante de aporte de N a los ecosistemas, mientras que la desnitrificación es el proceso biológico mayormente implicado en devolver N2 a la atmósfera. La desnitrificación consiste en una forma de respiración que llevan a cabo bacterias, arqueas y hongos bajo condiciones limitantes de oxígeno, en la cual tiene lugar la reducción de nitrato (NO3-) o nitrito (NO2-) hasta N2. Durante este proceso se generan como intermediarios el óxido nítrico (NO) y el óxido nitroso (N2O). El NO es un gas citotóxico a altas concentraciones, aunque a bajas, actúa como molécula señal. Por otro lado, el N2O es un potente gas de efecto invernadero. Tanto el NO como el N2O juegan un papel negativo en la atmósfera, contribuyendo a la destrucción de la capa de ozono. El proceso de desnitrificación consiste en cuatro reacciones enzimáticas secuenciales catalizadas por las enzimas nitrato-, nitrito-, óxido nítrico- y óxido nitroso reductasa, las cuales están codificadas por los genes nar/nap, nir, nor y nos, respectivamente (revisado en van Spanning et al, 2007; Kraft et al., 2011; Richardson et al., 2011 y Torres et al., 2016). La desnitrificación está ampliamente distribuida en el dominio Bacteria y la mayoría de los desnitrificantes se encuentran en el filo Proteobacteria (Shapleigh, 2006). En ese filo se encuentra la alpha-proteobacteria Gram-negativa, Bradyrhizobium diazoefficiens (Delamuta et al., 2013) que pertenece al orden Rhizobiales. Esta bacteria es capaz de establecer simbiosis con plantas de soja, dando lugar a la formación en sus raíces de unas estructuras especializadas, los nódulos, en cuyo interior tiene lugar el proceso de fijación de N2. En el nódulo, los rizobios invaden el citoplasma de las células infectadas y allí se diferencian en bacteroides, los cuales reducen el N2 a amonio, por acción de la enzima nitrogenasa. Además de fijar N2, B. diazoefficiens es capaz de desnitrificar, tanto en vida libre como en simbiosis, mediante la acción secuencial de las enzimas nitrato reductasa periplásmica (Nap), nitrito reductasa de Cu (NirK), óxido nítrico reductasa (cNor) y óxido nitroso reductasa (Nos), codificadas por los genes napEDABC, nirK, norCBQD, y nosRZDFYLX, respectivamente (revisado en Bedmar et al., 2005, 2013). En B. diazoefficiens existe una compleja red de regulación formada por dos cascadas interconectadas entre sí, FixLJ-FixK2-NnrR y RegSR-NifA, que controla la expresión de genes implicados en el metabolismo microóxico de esta bacteria tanto en vida libre como en simbiosis (revisado en Fernández et al., 2016 y Torres et al., 2016). La cascada de regulación FixLJ-FixK2-NnrR se activa a una concentración ≤5% O2, señal que es detectada y transducida por el sistema de regulación de dos componentes FixLJ que activa la transcripción de fixK2. La proteína FixK2 juega un papel clave en esta red de regulación, ya que no sólo constituye el nexo de unión con la cascada RegSR-NifA, sino que está implicada en la activación de aproximadamente 300 genes necesarios para el metabolismo microóxico, anóxico y simbiótico de esta bacteria (Mesa et al., 2008). Entre los genes regulados por FixK2 se encuentra el operón fixNOQP que codifica la oxidasa terminal cbb3 de alta afinidad por oxígeno, esencial para la respiración microóxica del bacteroide, o genes que codifican otros reguladores (p. ejem. rpoN1, fixK1 y nnrR) (Mesa et al., 2008). El gen nnrR codifica la proteína NnrR, un regulador transcripcional que induce la expresión de los genes de la desnitrificación en respuesta a óxidos de nitrógeno (NOX) (Mesa et al., 2003; Bueno et al., 2017; Torres et al., 2017). FixK2 y NnrR pertenecen a la familia de proteínas de tipo CRP/FNR, factores transcripcionales bacterianos que responden a un amplio rango de señales intracelulares y medioambientales (revisado en Körner et al., 2003). Estas proteínas constan de 4 dominios funcionales: un dominio de unión a efector en la región amino terminal, una estructura de lámina-β que se une a la ARN polimerasa, una hélice α involucrada en la dimerización y un dominio de unión a ADN. Este dominio interacciona con una secuencia conservada de ADN, la cual se localiza en la región promotora de los genes regulados por estas proteínas. En el caso concreto de FixK2, la secuencia de reconocimiento de ADN es un palíndromo de 14 pares de bases (TTGA/C-N6-T/GCAA; caja FixK2) (Bonnet et al., 2013). NnrR pertenece al clado NnrR que engloba a proteínas que modulan la expresión de los genes nir y nor, con el objeto de mantener la concentración de nitrito y NO por debajo de niveles citotóxicos (revisado en Körner et al., 2003). Otro subgrupo de proteínas CRP/FNR lo constituyen las de tipo DNR. Estudios espectroscópicos de DNR de Pseudomonas aeruginosa revelaron que esta proteína es capaz de unirse a NO como complejo DNR-hemo ferroso (Giardina et al., 2008). También se ha demostrado un mecanismo similar para la proteína DnrF de la bacteria marina Dinoroseobacter shibae (Ebert et al., 2017). En la región promotora de los genes de la desnitrificación y del gen nnrR de B. diazoefficiens existe una secuencia palindrómica similar a la caja FixK2, a la que a priori, podrían unirse FixK2 y/o NnrR. De hecho, la proteína FixK2 es capaz de activar in vitro la transcripción de los genes napEDABC y nirK, pero no la de los genes norCBQD (Bueno et al., 2017). Por el contrario, mediante calorimetría isotérmica de titulación, se observó que NnrR purificada en condiciones óxicas es capaz de interaccionar con el palíndromo presente en la región promotora de los genes norCBQD, exclusivamente cuando se aplicaron condiciones anóxicas a los experimentos (Bueno et al., 2017). Sin embargo, independientemente de las condiciones experimentales, NnrR no interaccionó con las secuencias palindrómicas presentes en las regiones 5’ de los genes napEDABC y nirK. Resultados previos del Grupo de Investigación del Metabolismo del Nitrógeno (EEZ-CSIC, Granada) habían demostrado la implicación de la proteína NnrR en el control directo o indirecto de los genes napEDABC, nirK, norCBQD y nosRZDFYLX (Mesa et al., 2003; Robles et al., 2006; Bueno et al., 2017 y Torres et al., 2017). Sin embargo, no se conocían otros genes implicados en el proceso de desnitrificación bajo el control de la proteína NnrR. En esta Tesis Doctoral se han identificado más de 170 genes simultáneamente inducidos en condiciones desnitrificantes y bajo el control positivo de NnrR. Entre ellos, se identificó el gen cycA, que codifica el citocromo soluble c550, previamente descrito como donador de electrones intermediario entre el complejo de membrana bc1 y la NirK. En este trabajo, se ha podido demostrar también la implicación de CycA en la actividad de la enzima óxido nitroso reductasa (Nos). Cuando se profundizó en la regulación del gen cycA, además del control por NnrR, se observó un control por la proteína FixK2 en condiciones de anoxia con nitrato, tanto a nivel transcripcional como traduccional. Es más, en ensayos de transcripción in vitro se pudo demostrar que la activación de la transcripción del gen cycA está controlada de forma directa por FixK2. Igualmente, en este trabajo se han identificado nnrR y nnrS, un gen localizado de forma divergente a nnrR, como dianas directas de FixK2. En el regulón de NnrR también se han identificado los genes nosRZDFYLX de cuya regulación se conoce muy poco. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral indicaron que estos genes constituyen una unidad transcripcional única, cuya expresión depende principalmente del promotor presente en la región 5’ del gen nosR, donde se identificaron dos inicios de la trascripción, TSS1 y TSS2 a 84 y 57 nt del ATG, respectivamente. Como se ha comentado anteriormente, en la región promotora de los genes nosRZDFYLX existe una secuencia palindrómica imperfecta que es parecida a la caja consenso de FixK2. Estudios de actividad β-galactosidasa de una fusión transcripcional nosR-lacZ y de expresión y actividad de la enzima Nos han demostrado que las condiciones limitantes de oxígeno constituyen la principal señal que induce la expresión de estos genes, siendo la proteína FixK2 la que controla y activa directamente la transcripción del operón nosRZDFYLX in vitro. La caracterización bioinformática de la proteína NnrR en base a su secuencia aminoacídica y a la estructura resuelta de DNR de P. aeruginosa han permitido predecir una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria que revela la presencia de los cuatro dominios típicos de las proteínas CRP/FNR, además de una cavidad hidrofóbica en la parte amino terminal, constituida por varios residuos de histidina que podrían actuar como ligandos de un posible cofactor. Estudios in vivo llevados a cabo con el objeto de profundizar en el mecanismo molecular de NnrR revelaron que el NO es la molécula señal para la máxima inducción de los genes norCBQD, ya que sus niveles de expresión disminuyeron considerablemente cuando se cultivaron las células en presencia de un secuestrador de NO. Además, NnrR es capaz de regular a los genes norCBQD en respuesta a NO de manera independiente a FixK2 de acuerdo a los resultados obtenidos en estudios de complementación de las cepas mutantes nnrR y fixK2 con el gen nnrR expresado in trans de forma constitutiva. Para demostrar la posible implicación del hemo como cofactor de NnrR, se realizaron estudios de expresión de una fusión norC-lacZ en una cepa mutante hemN2, la cual está afectada en la síntesis de hemo. Los datos de actividad β-galactosidasa indicaron la dependencia de hemo para la inducción por NO de los genes norCBQD, lo cual sugiere que el hemo es un posible cofactor de NnrR. La implicación del hemo como cofactor de NnrR también se estudió en ensayos in vitro. En primer lugar, se realizó una titulación de proteína NnrR recombinante con una solución de hemina en condiciones anóxicas, cuyos resultados proponen una unión entre NnrR y hemo con una estequiometría 1:1 (monómero NnrR:hemo). Además, el espectro UV-Vis de proteína NnrR reconstituida con hemo mostró un pico a 411 nm para la forma férrica y a 425 nm para el derivado reducido (ferroso), datos compatibles con las propiedades espectroscópicas de una unión NnrR-hemo. El complejo NnrR-hemo ferroso reaccionó con NO en condiciones anóxicas dando lugar al cambio del pico de 425 nm por 389 nm. De acuerdo con estos resultados, se puede proponer que el hemo es el cofactor más probable de NnrR que interviene en el mecanismo de detección de NO. Finalmente, en esta Tesis se han identificado los determinantes moleculares de la interacción discriminatoria de las proteínas FixK2 y NnrR con sus secuencias de reconocimiento (caja FixK2, caja NnrR). El intercambio de una timina por una adenina en posición 11 de la caja FixK2 presente en el promotor de los genes fixNOQP disminuyó, tanto la capacidad de interacción de FixK2 con esta caja como la de activación de la transcripción de dichos genes in vitro e in vivo. Sin embargo, el intercambio inverso (timina en lugar de adenina) del nucleótido 11 en la caja NnrR presente en el promotor de los genes norCBQD resultó, a diferencia de lo observado con la caja NnrR genuina, en una interacción efectiva de la proteína FixK2 con esta caja. Así mismo, dicha mutación permitió la activación de los genes norCBQD por FixK2 y la inducción de su expresión en condiciones de limitación de oxígeno en ausencia de nitrato. Teniendo en cuenta que NnrR es capaz de unirse directamente a la caja genuina NnrR presente en el promotor de los genes norCBQD, se considera el nucleótido 11 un factor clave en la discriminación entre la interacción de FixK2 y NnrR con ADN. En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral contribuyen a aumentar el conocimiento relacionado con la regulación de la desnitrificación en B. diazoefficiens, rizobio modelo para el estudio de dicho proceso. Concretamente, se ha avanzado en el mecanismo molecular implicado en el control de la desnitrificación mediado por las proteínas FixK2 y NnrR. Referencias Bedmar EJ, Bueno E, Correa D, Torres MJ, Delgado MJ, Mesa S. 2013. Ecology of denitrification in soils and plant-associated bacteria. Beneficial plant-microbial interactions: Ecology and applications:164-82 Bedmar EJ, Robles EF, Delgado MJ. 2005. The complete denitrification pathway of the symbiotic, nitrogen-fixing bacterium Bradyrhizobium japonicum. Biochem. Soc. 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