Uso del nitrógeno en algasdesvelando piezas del rompecabezas de la asimilación del nitrógeno y su regulación en el alga modelo chlamydomonas reinhardtii

Resum

1. introducción o motivación de la tesis Las algas, formando parte de la base de la cadena trófica de ecosistemas marinos y de agua dulce, son claves para la vida acuática. Estos organismos fotosintéticos, sometidos a fluctuaciones constantes de disponibilidad de nutrientes, muestran un alto nivel de adaptabilidad a estos ambientes dinámicos (Schlüter et al., 2016). Aunque el nitrógeno (N), nutriente esencial para la vida, es comúnmente usado por las algas en su forma inorgánica, algunas especies de algas pueden usar compuestos de N orgánico, los cuales pueden ser especialmente abundantes debido a la escorrentía y filtrado de áreas fertilizadas de forma intensiva (Fernandez and Galvan, 2007; Zuo et al., 2012). El alga modelo Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) puede consumir fuentes de N inorgánico (amonio, nitrato y nitrito), así como N orgánico (aminoácidos, urea). Además, este alga presenta una L-aminoácido oxidasa extracelular (LAO1) que desamina un amplio espectro de aminoácidos (Vallon et al., 1993). En este trabajo hemos estudiado el control de la señalización que da lugar a la preferencia de nitrato sobre N orgánico en Chlamydomonas, el papel clave de LAO1 en el uso de aminoácidos y péptidos, así como el establecimiento de nuevas interacciones mutualistas con bacterias que promueven el crecimiento en N orgánico. 2.contenido de la investigación El factor de transcripción NIT2 es el regulador clave de los genes de la asimilación de nitrato en Chlamydomonas (Camargo et al., 2007). En primer lugar, comparamos el transcriptoma de una estirpe silvestre y otra mutante nit2 de Chlamydomonas en respuesta a nitrato. Observamos que nitrato y NIT2 reprimen los genes involucrados en el uso de fuentes de N orgánicas, incluyendo LAO1. Mediante el uso de mutantes de Chlamydomonas demostramos que tanto el nitrato como el nitrito afectan negativamente el uso de aminoácidos por este alga. Las enzimas L-aminoácido oxidasa (LAAO, L-Amino Acid Oxidase) están ampliamente distribuidas en la naturaleza y un papel principal como captador de nitrógeno se ha propuesto en hongos y algas (Campillo-Brocal et al., 2015). Mediante búsquedas genómicas comparativas, no pudimos encontrar ningún ortólogo de LAO1 en ningún alga verde ni en plantas, pero identificamos ortólogos en 10 de otras 27 especies de algas, incluyendo Rhodophyta, Alveolata, Heterokonta, Haptophyta y Dinophyta. La construcción de un árbol filogenético de enzimas LAAO reveló que las secuencias identificadas como ortólogas de LAO1 -denominadas aquí como ALAAOs (Algal LAAOs)-, se agrupaban en la misma rama evolutiva. Observamos que en Chlamydomonas el gen LAO1 está situado adyacente a un gen que codifica una putativa proteína RidA, que resultó estar evolutivamente cercana a la de cianobacterias. Nuestro análisis filogenético apoya la idea de que las proteínas ALAAOs pueden tener un origen en el ancestro común de las algas, el cual se originó por la endosimbiosis de una cianobacteria por un protista. Mediante el uso de un mutante lao1 hemos mostrado que LAO1 era crucial para el crecimiento de Chlamydomonas en 16 de 20 aminoácidos proteinogénicos, así como para algunos di-/tri-péptidos. Además de amonio, las enzimas LAAO producen el correspondiente cetoácido y peróxido de hidrógeno. Hemos demostrado que la reacción espontánea de los productos derivados de la desaminación por LAO1 de L-alanina -ácido pirúvico y peróxido de hidrógeno- genera ácido acético, aliviando la generación de estrés oxidativo por acumulación de peróxido de hidrógeno. Aunque Chlamydomonas puede crecer en la mayoría de los L-aminoácidos y en algunos di-/tri-péptidos como únicas fuentes de N, este crecimiento es mucho menos eficiente que en fuentes de N inorgánicas, y además, algunos aminoácidos y péptidos no pueden ser usados por este alga (Chaiboonchoe et al., 2014). De forma fortuita descubrimos una contaminación Methylobacterium sp. que permitió el crecimiento de Chlamydomonas en un di-péptido que no puede asimilar. Las especies de Methylobacterium están incluidas en el grupo de bacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPB, del inglés Plant Growth-Promoting Bacteria), las cuales mejoran el crecimiento de las plantas (Dourado et al., 2015). Tras el muestreo en campo, aislamiento e identificación de bacterias, encontramos que algunas especies salvajes, incluidas en los géneros Methylobacterium, Sphingomonas, Deinococcus y Chitinophagaceae, mejoran el crecimiento de Chlamydomonas en L-serina. Además, algunas especies de Methylobacterium permitieron el crecimiento de Chlamydomonas en algunos aminoácidos y péptidos que este alga no puede usar. Hemos demostrado un nuevo mutualismo basando en un intercambio metabólico de carbono y nitrógeno entre Chlamydomonas y M. aquaticum. Por otro lado, algunas especies de Methylobacterium mejoraron el crecimiento de Chlamydomonas en aminoácidos asimilables. Para esta mejora, la enzima LAO1 fue esencial para el crecimiento del consorcio con algunas estirpes de Methylobacterium, incluyendo M. extorquens, M. hispanicum y M. organophilum. La comunicación química en la interacción entre organismos diferentes media las relaciones simbióticas. Entre estas moléculas de señalización, el ácido indolacético es una de las más estudiadas. Descubrimos que la producción de indoles dependiente de L-triptófano por Chlamydomonas, observada aquí por primera vez, disminuyó significativamente en el mutante lao1. Además, observamos que altas concentraciones de ácido indolacético (> 30 M) inhiben el crecimiento de Chlamydomonas y que esta inhibición se puede reducir por la presencia de especies de Methylobacterium. 3.conclusión En Chlamydomonas, nitrato y NIT2 reprimen los genes involucrados en el uso de fuentes de N orgánicas, incluyendo LAO1. Además, nitrato y nitrito reducen el uso de aminoácidos. En Chlamydomonas el gen LAO1 parece tener su origen en un evento de transferencia génica endosimbiótica desde el cloroplasto en el ancestro común de los arqueplástidos. Chlamydomonas puede crecer en todos los aminoácidos proteinogénicos, a excepción de la L-Prolina. Además puede crecer en los péptidos L-leucil-alanina, L-fenilanalil-alanina y L-leucil-glicil-glicina, pero no en glicil-glicil-glicina. Este crecimiento fue dependiente de LAO1 en todos los casos salvo en L-arginina. Los productos derivados de la actividad enzimática LAO1 en L-alanina, ácido pirúvico y peróxido de hidrógeno, pueden reaccionar generando ácido acético en el medio de cultivo. El co-cultivo con diferentes bacterias aisladas de la naturaleza, incluídas en los géneros Methylobacterium, Sphingomonas, Deinococcus, y Chitinophagaceae, mejoran el crecimiento de Chlamydomonas en L-serina. Además, determinadas especies de Methylobacterium permiten el crecimiento de Chlamydomonas en aminoácidos y péptidos que no son asimilables por este alga, como por ejemplo L-prolina, L-hidroxiprolina y L-glicil-glicil-glicina. Una interacción mutualista entre Chlamydomonas y M. aquaticum basada en un intercambio de carbono y nitrógeno permite que este alga crezca en L-prolina. En este consorcio, la bacteria mineraliza el aminoácido proporcionando nitrógeno asimilable por el alga (amonio) y el alga fija el dióxido de carbono atmosférico generando glicerol, una fuente de carbono asimilable por la bacteria. Algunas especies de Methylobacterium mejoran el crecimiento de Chlamydomonas en aminácidos. En algunas de estas interacciones, la enzima LAO1 es esencial para esta mejoría, incluyendo M. extorquens, M. hispanicum y M. organophilum. Por otro lado, esta enzima no fue necesaria en co-cultivo con otras especies como M. aquaticum, M. oryzae y M. aerolatum. En presencia de L-triptófano, Chlamydomonas sintetiza indoles. Sin embargo, esta síntesis fue muy reducida en el mutante de LAO1. Por otro lado, altos niveles de la auxina ácido indolacético inhibe el crecimiento de este alga. Esta inhibición puede ser reducida por la presencia de especies de Methylobacterium. 4. bibliografía Camargo, A., Llamas, A., Schnell, R. a, Higuera, J. J., González-Ballester, D., Lefebvre, P. a, et al. (2007). Nitrate signaling by the regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell 19, 3491–3503. doi:10.1105/tpc.106.045922. Campillo-Brocal, J. C., Lucas-Elió, P., and Sanchez-Amat, A. (2015). 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