Efecto del tratamiento con metformina en el sistema dopaminérgico nigroestriadoPosible implicación en la enfermedad de parkinson

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden relacionado con la edad caracterizado por la degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales de la sustancia negra compacta (SNpc), lo que produce la disfunción motora del sistema extrapiramidal acompañado por una pérdida progresiva de autonomía, cambios de humor y disfunciones cognitivas. Aunque se han identificado diversos genes como responsables de un tipo raro de EP familiar de rápida aparición, la etiología de la enfermedad sigue siendo desconocida. Se piensa que el estrés oxidativo, la reducción en los factores tróficos, la disfunción mitocondrial, las alteraciones en el sistema ubiquitina-proteosoma y los mecanismos neuroinflamatorios colaboran en la muerte progresiva de las neuronas de la SNc. Existen evidencias que sugieren que la inflamación puede jugar un papel central en la pérdida celular que se produce en la EP. Estas observaciones se basan en la existencia de microglía activada en la SN de pacientes con EP. Este incremento en el número de células microgliales activadas va acompañado de un aumento en la expresión de citoquinas inflamatorias. Así, se ha demostrado que la inflamación está presente en diferentes modelos animales de EP, incluidos los producidos por las toxinas MPTP, 6-OHDA o rotenona. Asimismo se sabe que dosis subtóxicas del proiflamógeno lipopolisacárido (LPS) aumenta la progresión de la enfermedad en un modelo animal de EP, lo que indica que la inflamación cerebral puede jugar un importante papel en la progresión de la enfermedad. De hecho, estudios epidemiológicos han demostrado que la incidencia de EP idipático es cerca del 50% menor en consumidores crónicos de anti-inflamatorios no esteroides o de inhibidores de la ciclooxigenasa con respecto a los que no los usan. Aunque, como ya se ha comentado, la causa de la enfermedad se desconoce en la mayor parte de los casos, se sabe que existen diversos factores de riesgo que pueden aumentar las probabilidades de desarrollar la enfermedad, entre los que se encuentran la edad, transtornos del sueño, traumatismos cerebrales y la exposición a determinados factores ambientales como pesticidas y herbicidas. En este sentido la diabetes mellitus también ha empezado a considerarse como un posible factor de riesgo para padecer este desorden neurodegenerativo. La asociación entre diabetes y EP no está completamente clara, pero puede que la inflamación crónica y el estrés oxidativo producidos en la diabetes lleven a un mayor riesgo de padecer EP años después. Además, estudios animales e in vitro muestran un papel para la insulina en la regulación de la actividad dopaminérgica del cerebro. La desregulación y los cambios de acción de la insulina han sido motivo de estudio en la patofisiología y síntomas clínicos de la EP. También se ha visto reducción de la expresión de ciertos genes en la diabetes tipo 2, lo que se ha relacionado con daño en la vía de oxidación mitocondrial, mientras que la disfunción mitocondrial se ha sugerido como posible causa patogénica de la EP. Uno de los fármacos mundialmente aceptados para el tratamiento de la diabetes es la metformina. La metformina, químicamente denominada clorhidrato de metformina, es un miembro de la clase de las biguanidas que reduce la producción de glucosa hepática y disminuye la resistencia a la insulina, así como los niveles de insulina plasmática en ayunas a través de un mecanismo de acción que parece estar mediado fundamentalmente por la activación de la proteína quinasa activada por la adenosina monofosfato (Adenosine-Monophosphate Activated Protein Kinase; AMPK). Recientemente se han desarrollado diversos estudios clínicos y experimentales que sugieren que la metformina, a parte de su acción hipoglucemiante, puede atenuar la inflamación, tanto periférica como central. El potencial anti-inflamatorio de la metformina se ha descrito especialmente en numerosos modelos experimentales de inflamación periférica, de manera que se ha demostrado que la metformina disminuye la respuesta inflamatoria en las células endoteliales, disminuye la proliferación celular en el músculo liso de aortas humanas y mejora la activación de los macrófagos. Dada la relevancia de la neuroinflamación en el desarrollo de la EP y la actividad anti-inflamatoria de la metformina, el objetivo del presente trabajo es determinar si el tratamiento con este fármaco es capaz de proteger a las neuronas dopaminérgicas de la SNc de un fuerte estímulo inflamatorio inducido a través de dos modelos animales de EP: el inducido por la inyección intranigral del inflamógeno LPS y el inducido por la inyección intraperitoneal de la neurotoxina MPTP. En este estudio se utilizaron ratas albinas machos de la raza WISTAR y ratones machos de la raza C57Bl (20-25 g). Para el modelo de EP por inyección de LPS los animales fueron distribuidos en 4 grupos, de acuerdo a 2 variables distintas: según la solución ingerida (agua o metformina) y según el producto inyectado en la SN (vehículo o LPS). Para el modelo de EP por inyección de MPTP los animales fueron distribuidos en 4 grupos, de acuerdo a 2 variables distintas: según la solución ingerida (agua o metformina) y según el producto inyectado i.p. (vehículo o MPTP). Para estudiar los efectos del tratamiento con metformina sobre el sistema dopaminérgico nigroestriado se han llevado a cabo técnicas inmunohistoquímicas combinadas con técnicas estereológicas para determinar el número de neuronas dopaminérgicas supervivientes tras los dos tratamientos mencionados. Así mismo, se llevaron a cabo técnicas de HPLC para cuantificar el contenido de dopamina y DOPAC en el estriado de los animales, como una medida indirecta de la pérdida neuronal en la SNpc. Como ya se ha comentado, uno de los posibles mecanismos protectores de la metformina es su capacidad para inhibir la inflamación, por lo que se estudió el grado de inflamación cerebral tanto a nivel celular como molecular. La densidad de microglía reactiva se cuantificó a partir de criterios morfológicos por inmunohistoquímica de Iba1 y OX-6. Para el estudio de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, tales como el TNF-α, la iL-1β o la enzima iNOS, se llevaron a cabo técnicas de RT-PCR. Para completar los estudios in vivo, se llevaron a cabo estudios in vitro a través del cultivo de células dopaminérgicas mesencefálicas inmortalizdas de rata (N27) a las que se trataron con diferentes dosis de MPP+ y de metformina. A partir de estos cultivos celulares se estudiaron la viabilidad neuronal, la producción de radicales y la producción de ATP bajo los distintos tratamientos. Finalmente, se llevaron a cabo estudios por citometría de flujo para determinar el tipo de muerte (necrótica o apoptótica) que se produce con los distintos tratamientos ensayados. Todos estos datos nos han permitido estudiar el efecto del tratamiento con metformina sobre las neuronas dopaminérgicas de la SN tras un daño originado por dos modelos diferentes. Nuestros resultados muestran como el tratamiento con metformina produce una disminución en el número de células microgliales activadas en los dos modelos estudiados, como se puso de manifiesto a través de técnicas de inmunocitoquímica frente al OX-6 e Iba-1. Por otro lado, el análisis a nivel molecular nos reveló que el tratamiento con metformina es capaz de disminuir los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias como la IL-1β, la iNOS y el TNF-α. Sin embargo, cuando examinamos el efecto del tratamiento con metformina sobre las neuronas dopaminérgicas observamos que, lejos de proteger, la metformina aumenta el daño sobre este tipo de neuronas. Al igual que se ha observado en el estudio in vivo, la metformina combaniada con MPP+ produjo un efecto negativo sobre la viabilidad celular, muerte celular, niveles de ATP y el estrés oxidativo. Nuestros resultados sugieren por tanto, que el tratamiento con metformina en pacientes diabéticos puede aumentar el riesgo de padecer EP. Teniendo en cuenta que las enfermedades neurodegenerativas son una de las complicaciones frecuentes en pacientes con diabetes mellitus y dados los pocos estudios epidemiológicos al respecto, parece necesario profundizar en las repercusiones que el tratamiento con metformina u otros antidiabéticos orales pueda tener en el desarrollo de la EP y la enfermedad de Alzheimer.