Regulación de la expresión de la ruta de degradación de compuestos dihidroxilados en azoarcus anaerobius y thauera aromatica ar-1

Zusammenfassung

Los compuestos aromáticos son muy abundantes en la naturaleza, donde la lignina, los aminoácidos aromáticos, las quinonas, flavonoides y otros compuestos con origen natural están presentes formando parte de las estructuras biológicas o como cofactores en las diferentes reacciones enzimáticas. Las características de los compuesto aromáticos han propiciado su uso industrial en distintos campos, generándose incluso nuevos compuestos de carácter xenóbiotico. Estos han sido introducidos en el ambiente por su uso frecuente o a consecuencia de vertidos accidentales, presentando una persistencia muy alta en el medio. En muchos casos estos compuestos presentan una alta toxicidad con alto riesgo para la salud humana, lo que genera gran preocupación en las agencias de medioambiente. Sin embargo su disponibilidad como sustrato para servir de fuente de crecimiento para los microorganismos ha permitido que estos hayan desarrollado sistemas o mecanismos para su uso eficiente gracias a la plasticidad génica y a la promiscuidad funcional de muchas de las enzimas que participan en las rutas de degradación. Desde hace varias décadas el estudio de la mineralización de compuestos aromáticos se ha centrado en las bacterias aerobias. Sin embargo la gran mayoría de los ambientes contaminados por aromáticos presentan condiciones de anoxia total o parcial. Por tanto es importante estudiar la degradación de estos compuestos en condiciones anaerobias. Nuestro trabajo se ha centrado en el estudio de la degradación anaerobia de dos compuestos monoaromáticos dihidroxilados, resorcinol y 3,5-dihidroxibenzoato (3,5-DHB), en bacterias desnitrificantes. En esta tesis se ha estudiado la única vía descrita actualmente que emplea una oxidación independiente de oxígeno para el ataque del anillo aromático hidroxilado en condiciones de anaerobiosis. Las dos rutas analizadas se encuentran en Azoarcus anaerobius y Thauera aromatica AR-1, dos bacterias desnitrificantes (NRB) que degradan resorcinol (1,3-dihidroxibenceno) y 3.5-dihidroxibenzoato (3,5-DHB, α-resorcilato) respectivamente. Estas cepas presentan la capacidad de utilizar estos compuestos como única fuente de carbono. A. anaerobius es una bacteria anaerobia estricta, mientras que T. aromatica AR1 es anaerobia facultativa. Al inicio de esta tesis se conocían las bases bioquímicas de la degradación anaerobia de estos compuestos y se había definido la agrupación de genes que codifican los distintos pasos de la ruta en cada organismo. Así mismo se habían señalado posibles reguladores de las rutas. Aunque existe una gran similitud entre los principales genes de la ruta de ambas agrupaciones génicas, se han identificado varias diferencias relevantes entre ellas: i) presencia de un sistema de transporte de tipo TRAP en T. aromática y ausencia de sistema de transporte específico en A. anaerobius. ii) distintos reguladores transcripcionales en cada ruta: RedR1 y RedR2, pertenecientes a la familia NtrC, también conocidos como proteínas de unión a potenciadores bacterianos (bEBP), en A. anaerobius, y DbdR, perteneciente a la familia de reguladores de tipo LysR (LTTR), en T. aromatica. Con este punto de partida, el objetivo de esta tesis se centró en analizar los mecanismos de regulación de ambas rutas. En los capítulos 4.1 y 4.2 estudiamos la regulación de la degradación anaerobia de resorcinol en Azoarcus anaerobius. En primer lugar definimos la organización transcripcional de los genes de la ruta mediante análisis de RT-PCR. Establecimos la existencia de cinco operones, tres de los cuales son inducibles por sustrato y codifican las principales enzimas de la ruta. Mediante extensión a partir de cebador establecimos que los promotores de los tres operones presentaban una estructura típica de promotores dependiente de σ54, y que su máxima actividad estaba mediada por la acción coordinada de los reguladores RedR1 y RedR2, aunque RedR2 parecía tener un papel más relevante en la expresión; de hecho, la expresión de RedR1 dependía de RedR2. Ambas proteínas tienen una identidad del 97% entre sí y las diferencias están localizadas en los extremos N-terminal (NTD) y C-terminal (CTD). Por homología con DhaR, otro regulador de la misma familia, en el extremo N-terminal se ambas proteínas se identifican dos dominios en tandem GAF-PAS. En el extremo C-terminal se definió el dominio HTH de reconocimiento del ADN, identificándose las distintas hélices que forman este dominio, con algunas diferencias entre RedR1 y RedR2 que podrían explicar por qué presentan mecanismos de activación diferentes. Efectivamente, sugerimos que RedR1 responde a un mecanismo clásico de activación negativo mediada por el dominio N-terminal, frente al mecanismo de RedR2, que definimos como un activador constitutivo reprimido por interacción directa con BtdS, una proteína de membrana perteneciente al complejo enzimático de BtdLS, que lleva a cabo la transformación de hidroxihidroquinona (HHQ) hasta hidroxibenzoquinona (HBQ) y que en ausencia de sustrato secuestra a RedR2 en la membrana. Esta interacción ocurre a través de la cola N-terminal de RedR2 y no ocurre con RedR1. Pudimos establecer mediante ensayos de doble híbridos la interacción física entre ambos reguladores a través del dominio central, necesaria para el ensamblaje a heterohexámero, que sería su forma activa más eficiente para alcanzar la máxima activación de los promotores. En solución no se detecta interacción de los reguladores consigo mismo. Sin embargo sugerimos que RedR2 sí puede formar homodímeros si su dominio de unión a ADN está contactando con sus secuencias diana (UASs), lo que estabilizaría la formación de homohexámeros activos. Igualmente proponemos que la formación de homodímeros de RedR1 está reprimida por su NTD, y que en ausencia de éste la homodimerización también requiere de la unión a sus UASs. Para identificar el efector de la ruta realizamos una primera aproximación mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC) de ambas proteínas con posibles efectores, sin éxito. Utilizando una aproximación genética con los mutantes de los principales pasos de la ruta se estableció la necesidad de la transformación de resorcinol hasta HBQ para la activación de los promotores. El conjunto de nuestros resultados nos ha permitido proponer un modelo de regulación de la ruta de degradación en A. anaerobius, que implica mecanismos de control de las proteínas reguladoras muy novedosos. En el capítulo 4.3 estudiamos los mecanismos de regulación de la ruta de degradación de 3,5-DHB en T. aromatica AR1. Hemos establecido que DbdR es el regulador específico de la ruta y en su secuencia identificamos los dominios característicos de la familia LTTR (LysR type transcriptional regulators). Hemos establecido que su estado nativo en solución es un tetrámero. Los promotores principales de la ruta identificados mediante extensión a partir de cebador presentan elementos altamente conservados, identificándose los posibles sitios RBS (sitio de unión regulatorio) y ABS (sitio de unión de activación) típicos de reguladores de la familia. Mediante ensayos de retardo en gel (EMSA) con extractos donde se había sobreexpresado DbdR se determinó la unión de la proteína a las regiones promotoras de los operones para los principales pasos de la ruta. No se pudo identificar el efector de la ruta mediante ITC, pero mediante una aproximación genética hemos identificado dos posibles candidatos a ser el efector que activa DbdR: HHQ y 2,3,5-trihidroxibenzoato (2,3,5-THB), ambos intermediarios de la ruta. Por tanto es necesaria la transformación del 3,5-DHB a 2,3,5-THB o HHQ para la activación. Hemos establecido que DbdR activa a varios promotores de la ruta a la vez y controla positivamente su propio promotor. Esto es algo poco descrito en los miembros de esta familia de reguladores, que suelen presentar regulación negativa de su propio promotor, y suelen activar al promotor del gen divergente al suyo. Estos son los primeros datos obtenidos sobre el mecanismo de acción de este regulador.