Plataformas Multifuncionales Basadas en CiclodextrinasDiseño de Antitoxinas del Ántrax y Vectores de Genes

Abstract

El objetivo general planteado en esta tesis es el desarrollo de sistemas macromoleculares nanométricos capaces de interaccionar selectivamente con biomoléculas (proteínas, ADN) mediante modificación química de ciclomaltooligosacáridos (ciclodextrinas, CDs) y su aplicación al diseño de antitoxinas frente al ántrax y de vectores de genes. En el primer apartado de este trabajo se ha investigado la utilidad del concepto de síntesis asistida por soportes sólidos para la derivatización selectiva de plataformas polifuncionales en general y de ciclodextrinas en particular. La síntesis en fase sólida se ha convertido en una herramienta eficaz, fiable y popular para la preparación de péptidos y oligonucleótidos, pero ha sido poco investigada en el campo de los glicoconjugados. La ventaja de este tipo de técnicas consiste en la facilidad para la separación y purificación de productos, lo que permite usar excesos de reactivos para conseguir completar las reacciones. Combinando dicha estrategia con el concepto del anclaje de liberación controlada (una función química de unión al soporte sólido resistente a las condiciones de elaboración del elemento funcional y que, tras una modificación selectiva, puede hacerse suficientemente reactiva) se ha desarrollado una metodología que permite transferir conjugados previamente construidos sobre el soporte sólido a una molécula en disolución de manera quimioselectiva, minimizando los inconvenientes asociados a la elaboración y purificación de macromoleculas. Se han sintetizado de esta manera una serie de glicodendrímeros y se ha demostrado la utilidad de esta aproximación para la preparación de conjugados glicodendrímero-ciclodextrina. Además, se ha explorado la posibilidad de extender esta metodología a la transferencia de más de un elemento preformado sobre el soporte sólido a una misma molécula con varios centros reactivos, con resultados prometedores. En el segundo apartado de esta tesis se ha explorado la posibilidad de construir derivados de CD que puedan bloquear la acción de la toxina del ántrax bloqueando el tráfico a través de los poros que facilitan su internalización en la célula. El ántrax es una enfermedad causada por una bacteria típicamente asociada al ganado vacuno y lanar que puede resultar letal tanto para estos animales como para el ser humano. El índice de mortalidad por inhalación de las correspondientes esporas es próximo al 100%, lo que ha convertido al ántrax en una de las amenazas bioterroristas más temidas. La toxina del ántrax está constituida por tres proteínas: un factor letal, un factor de edema y un antígeno protector. Éste último es el encargado de facilitar el acceso de las otras dos al interior celular mediante la formación de un poro de simetría heptamérica y densidad de carga negativa a través de la membrana celular. Las vacunas desarrolladas hasta la fecha para prevenir esta enfermedad no reúnen los requisitos impuestos por la medicina moderna. Partiendo del principio de que una simetría compatible entre un receptor biológico y su ligando suele reforzar significativamente su interacción, se han diseñado y sintetizado derivados de ciclomaltoheptaosa (ßCD) policatiónicos y solubles en agua para estudiar su comportamiento como antitoxinas del ántrax. Dichos estudios se han llevado a cabo con la colaboración del Dr. V. Karginov (E.E.U.U.) con resultados positivos, llegando a un IC50 inferior a 1 ¿M. En el tercer apartado se han explotado estrategias de derivatización selectiva de ambas caras de las CDs para elaborar derivados anfifílicos y homogéneos capaces de autoorganizarse en presencia de ácidos nucleicos y de actuar como vectores de genes en terapia génica. Esta terapia consiste en transferir al interior celular un gen capaz de interferir en la biosíntesis de alguna proteína directamente implicada en el desarrollo de la enfermedad. El mayor reto tecnológico de esta técnica es el de la administración, ya que las propiedades de los ácidos nucleicos hacen inviable una administración directa. Se han descrito técnicas físicas y asistidas por vectores para lograr este objetivo pero, hasta la fecha, no se ha encontrado un método que cumpla las condiciones necesarias para su correcta aplicación. La capacidad de encapsulación, protección y transporte de material génico de las CDs policatiónica anfifílicas preparadas en esta tesis pueden ser manipuladas químicamente, lo que ha permitido obtener vectores artificiales en posición de competir con los que lípidos y polímeros catiónicos comercialmente disponibles y que presentan un gran potencial. La caracterización del comportamiento de estos vectores en disolución, en colaboración con el Dr. A. Mazzaglia (Italia), las propiedades estructurales y eficacia de transfección de los complejos formados (CDplejos), en colaboración con el Dr. P. Vierling (Francia), y el estudio de los mecanismos de endocitosis por los que se internalizan en las células, en colaboración con los doctores S. de Smedt y J. Rejman (Bélgica), ha proporcionado una información valiosa sobre las relaciones de estructura/actividad, lo que facilitará su optimización. Además, la incorporación de elementos biocompatibles y de reconocimiento selectivo han permitido obtener nuevos derivados capaces de favorecer la expresión del material génico en células diana que expresan receptores complementarios.