Proteínas dependientes de flavinabiosíntesis de cofactores flavínicos y procesos de interacción y transferencia de electrones

Resumen

FMN y FAD, las formas biológicamente activas de la RF, actúan como cofactores de flavoproteínas participando en multitud de rutas metabólicas muy importantes para las células. Su síntesis a partir de la RF tiene lugar mediante la acción secuencial de dos actividades enzimáticas, una actividad riboflavina quinasa y una actividad adenililtransferasa. En organismos procariotas estas dos actividades residen en una única proteína, la FAD sintetasa (FADS). En mamíferos y levaduras, la síntesis de FMN y FAD está catalizada por dos enzimas monofuncionales que actúan de forma independiente, una riboflavinakinasa (RFK) y una adenililtransferasa (FMNAT). Las características diferenciales entre las enzimas monofuncionales y las FADSs de procariotas convierten a estas enzimas en potenciales dianas terapéuticas. En este trabajo se ha analizado el mecanismo de acción de la enzima responsable de la síntesis de los cofactores flavínicos en procariotas utilizando como modelo la FADS de Corynebacterium ammoniagenes. El análisis secuencial de las FADSs de organismos procariotas muestra la existencia de varios motivos conservados que se propone que participan en la unión a los ligandos. Además se ha propuesto un modelo estructural de la enzima libre y en complejo con sus ligandos. Estos resultados nos han permitido seleccionar posibles residuos en cada uno de los dominios de la enzima para analizar su implicación en la unión a los ligandos así como en la catálisis, con el fin de identificar los residuos catalíticos de cada una de las actividades de la FADS. Así se ha comprobado que en el módulo RFK los residuos T208, N210 y E268 están implicados en la unión a los ligandos. Además los residuos T208 y E268 están directamente implicados en la catálisis, siendo la T208 la responsable de la estabilización del ATP y el residuo E268 el responsable de la activación de la RF para que se produzca la reacción de fosforilación. En el módulo FMNAT, se ha comprobado que las cadenas laterales de los residuos H28, H31, R161, S164 y T165 son las responsables de proporcionar el ambiente polar adecuado para que se produzca la unión de los ligandos y la formación del complejo catalíticamente competente. Además se ha demostrado que el residuo H31 actúa como base catalítica produciendo el ataque nucleofílico que libera el pirofosfato y estabilizando el estado de transición para producir el nuevo enlace fosfodiéster para formar el FAD. Por otro lado se ha profundizado en el estudio de los mecanismos de interacción y transferencia electrónica desde el PSI al NADP+ a través de dos flavoproteínas, Flavodoxina (Fld) y Ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR). El análisis de los residuos hidrofóbicos de la Fld en la interacción proteína-proteína indica que los residuos W57, I59 e I92 no son críticos para la formación de los complejos productivos entre la Fld y sus parejas redox. Los resultados sugieren que la Fld no establece interacciones específicas con sus parejas redox. Además el uso de un sistema de detección de diodos acoplado a métodos de mezcla rápida con flujo detenido nos ha permitido proponer los procesos de transferencia electrónica detectables para la reacción entre Fld y FNR, tanto para el proceso fotosintético como para el reverso. El estudio de la dependencia de la fuerza iónica para ambos procesos indicó que en condiciones fisiológicas la Fld no alcanza la máxima eficiencia en la transferencia electrónica. Todos estos resultados indican que la Fld ha evolucionado para alcanzar un compromiso entre la especificidad de unión y la eficiencia con el fin de interaccionar con varias parejas de reacción en el mismo sitio de unión a costa de reducir la eficiencia.