Efectos del estrés oxidativo sobre la excitabilidad de las neuronas piramidales de la corteza motora

Resumen

El estrés oxidativo y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) juegan un papel muy importante en el daño neuronal. Numerosas evidencias apuntan a que contribuyen a la degeneración neuronal que subyace a muchas enfermedades neurodegenerativas, como son la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. No obstante, los mecanismos específicos responsables de la neurodegeneración no se conocen con exactitud. Este proyecto tiene como finalidad conocer, mediante la técnica de whole-cell patch-clamp, el impacto del estrés oxidativo sobre la excitabilidad neuronal y las propiedades funcionales de membrana. El estudio se realizó en neuronas piramidales de la corteza motora usando rodajas de cerebro de ratas jóvenes adultas. La formación de radicales libres derivados de oxígeno fue inducida mediante la perfusión de la rodaja durante un intervalo de 5 a 30 minutos con un hidroperóxido orgánico, el hidroperóxido de cumeno (HC), que produce peroxidación lipídica (LPO). La exposición de las células a HC 10 μM produjo grandes cambios en las propiedades electrofisiológicas de las neuronas, la mayoría de los cuales ya fueron significativos a los 5 minutos tras la aplicación del oxidante. El potencial de membrana de reposo de las neuronas se despolarizó progresivamente durante la exposición. La resistencia de la membrana aumentó a los 5 minutos de aplicación del oxidante, para luego disminuir con respecto al control a los 15 y 30 minutos. Como consecuencia de estos cambios en resistencia se encontraron cambios en la reobase que disminuyó a los 5 minutos y, posteriormente, aumentó a los 15 y 30 minutos tras la tras la administración de HC. El voltaje de despolarización disminuyó progresivamente durante la aplicación del HC, sin cambios en el voltaje umbral, y de forma paralela al descenso en el potencial de membrana de reposo. Además, la amplitud del potencial de acción disminuyó, mientras que la duración del potencial aumentó, de forma progresiva a lo largo del tiempo cuando se aplicó el HC. El efecto del HC sobre las propiedades repetitivas de las neuronas fue heterogéneo. Así, algunas de las neuronas estudiadas (13/30) perdieron completamente la capacidad de disparar repetitivamente potenciales de acción tras la aplicación de HC, mientras que otras conservaron el disparo (17/30). Estas últimas neuronas, sin embargo, disminuyeron de forma progresiva tanto la frecuencia máxima de disparo como la ganancia tras la aplicación del oxidante, mostrando un rango de trabajo mucho menor. El estrés oxidativo, inducido por el HC, produjo importantes cambios en la excitabilidad neuronal de la corteza motora de forma dosis y tiempo dependiente. A concentraciones de 1 μM, concentración que no produce efecto alguno en otras poblaciones neuronales, el HC produjo el bloqueo de corrientes rectificadoras (sag) y disminuyó la amplitud del potencial de acción y la ganancia de la frecuencia de disparo. No obstante, no se observaron cambios significativos en el resto de parámetros fisiológicos. La administración de HC 100 μM produjo el bloqueo completo de la capacidad de disparar potenciales de acción de forma repetitiva en todas las células registradas. El efecto sobre el resto de parámetros no fue significativamente diferente al producido por 10 μM. El efecto del HC, es además dependiente del tamaño neuronal. Así, las células de mayor tamaño (estimado mediante su capacitancia celular) son las más sensibles al estrés oxidativo. El gran tamaño que presentan las neuronas piramidales y la alta sensibilidad demostrada al estrés oxidativo hacen que esta población neuronal sea mucho más susceptible a la muerte neuronal que otras poblaciones. Con la finalidad de comprobar si todos estos cambios en las propiedades de membrana eran debidos a un efecto directo sobre las neuronas piramidales o eran consecuencia de alteraciones a nivel presináptico, se estudió el efecto del estrés oxidativo sobre las entradas sinápticas. En general, el HC produjo una depresión de las entradas sinápticas, demostrando así que los cambios funcionales producidos por el estrés oxidativo se deben a mecanismos pre y postsinápticos. En particular, el HC disminuyó la amplitud, frecuencia y constante de bajada de las corrientes postsinápticas espontáneas tanto excitadoras (sEPSC) como inhibidoras (sIPSC). Sin embargo, no se observó ningún efecto sobre las corrientes postsinápticas miniatura ni excitadoras (mEPSC) ni inhibidoras (mIPSC). Estos resultados podrían deberse a la acción presináptica del HC que causaría una disminución de la liberación de neurotransmisores dependientes de potencial de acción. La disminución de las entradas inhibidoras desde las interneuronas premotoras produjo, a su vez, la disminución de una corriente tónica dependiente de receptores GABAA presente en las neuronas piramidales. Esta disminución sería la responsable de la hiperexcitabilidad transitoria (aumento de la resistencia junto con una disminución en reobase) encontrada en las neuronas piramidales durante los primeros minutos tras la administración del oxidante. Este incremento en la excitabilidad cortical es característica de pacientes con ELA. En general, los efectos producidos por el HC fueron irreversibles. Tan sólo cuando el lavado se realizó a los 5 minutos de exposición al oxidante se restableció la normalidad en algunos parámetros, como la resistencia. Este dato es relevante, porque significa que la eficacia de los Resumen | 5 agentes neuroprotectores dependería de la etapa en la que se produzca su administración. Así, en este estudio se demostró que la preincubación con el antioxidante melatonina previne la LPO y los cambios electrofisiológicos inducidos por el HC. Nuestros hallazgos permiten proponer a la melatonina como un agente neuroprotector que podría utilizarse como estrategia terapéutica en el tratamiento temprano de enfermedades neurodegenerativas. En conclusión, podemos decir que el estrés oxidativo, en gran parte a través de la LPO, compromete la excitabilidad neuronal a través de mecanismos pre y postsinápticos, produciendo, entre otros, una hiperexcitabilidad transitoria durante los primeros estadios de la oxidación que es característica de la ELA. Por lo tanto y asumiendo que el estrés oxidativo contribuye al desarrollo de esta patología, proponemos que la LPO, por un lado alterando la inhibición cortical (tónica y fásica) y por otro lado afectando directamente la excitabilidad de las neuronas piramidales, conduciría a la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades neurodegenerativas como la ELA.