Biobed biopurification systems with agroindustrial wastes to remove organic contaminants from watermicrobiological and molecular aspects

Resumen

El deterioro de la calidad del agua debido a la presencia de contaminantes orgánicos generados por las actividades industriales, agrícolas y urbanas conlleva una problemática ambiental ya que afecta a la calidad de los ecosistemas y a la salud humana. Junto a los plaguicidas, comienzan a ser un problema la acumulación de otros contaminantes emergentes como los productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCP-Pharmaceutical and personal care products). En general, la degradación de estos contaminantes durante el tratamiento convencional en plantas depuradoras de aguas residuales basado en lodos activados suele ser incompleta y permanecen en los efluentes que son descargados al medio ambiente (Fekadu et al., 2019; Petrović et al., 2003; Rosal et al., 2010). Estas plantas depuradoras carecen de medios para detectar y eliminar completamente estos contaminantes ya que en principio no se diseñaron para este fin. En consecuencia, la entrada incontrolada de estas sustancias en los ecosistemas contribuye a su detección en aguas superficiales y subterráneas, suelo, sedimentos, sólidos en suspensión e incluso en el agua de consumo humano (Houtman, 2010; Jurado et al., 2019; Wilkinson et al., 2017). Estos contaminantes son nocivos para numerosos organismos terrestres y acuáticos, actuando generalmente como disruptores endocrinos (Farré et al., 2008; Houtman, 2010; Nilsen et al., 2019). Por estos motivos, y teniendo en cuenta la creciente demanda de este recurso natural indispensable para el desarrollo de la humanidad y del medioambiente, así como las exigencias de la Directiva Marco del agua (2000/60/CE) referente a la recuperación de la calidad química y ecológica de las aguas, es una prioridad científico-técnica de interés mundial desarrollar sistemas que permitan eliminar de forma eficiente y sostenible los contaminantes orgánicos de las aguas y evitar así su impacto en otros compartimentos ambientales (Grassi et al., 2013). Entre las técnicas de biorremediación destacan los sistemas de biopurificación (BPSs-Biopurification systems), también conocidos como biobeds o “camas biológicas”, los cuales son de fácil implantación y han resultado ser muy eficientes para evitar contaminaciones puntuales que puedan ocurrir durante la carga y limpieza de la maquinaria de dispersión de pesticidas (Castillo et al., 2008). Estos sistemas consisten en excavaciones o contenedores rellenos de biomezclas activas que retienen y degradan los contaminantes, y han llamado la atención en numerosos países donde se está trabajando para adaptarlo a las condiciones y aplicaciones locales (De Wilde et al., 2007; Dias et al., 2020). La biomezcla original consiste en suelo, turba (materia orgánica estable) y paja (agente estructurante) en proporciones 25:25:50 % en volumen. No obstante, la escasez de estos materiales en algunas regiones ha llevado a la búsqueda de otros materiales alternativos más disponibles y económicos en la zona. En España, nuestro grupo de investigación ha desarrollado por primera vez biomezclas a partir de residuos orgánicos de bajo coste muy abundantes en nuestra región procedentes de la agroindustria del aceite de oliva (alperujo y la poda de olivar), residuos de invernadero y de la producción del vino o alcohol (lodos de vinaza, orujillo y sarmientos). Estudios previos han descrito la eficacia de estas biomezclas para eliminar diversos tipos de pesticidas y se ha seleccionado la biomezcla más óptima para extender la aplicación de estos sistemas de biopurification para eliminar los PPCPs presentes en aguas residuales (Delgado-Moreno et al., 2019, 2017). En esta memoria de tesis doctoral se inicia una investigación de carácter multidisciplinar que aborda diversos aspectos bioquímicos, microbiológicos y genéticos de un sistema de biopurificación, a fin de demostrar su utilidad para eliminar de forma eficiente tres PPCPs, ibuprofeno, diclofenaco y triclosan, que frecuentemente se detectan en los recursos hídricos. Asimismo, se ha estudiado la ecotoxicidad de estos compuestos y su impacto sobre la biodiversidad de las poblaciones microbianas empleando técnicas microscópicas y de secuenciación masiva. En esta tesis doctoral también se desarrollan técnicas de bioaumentación a fin de promover una eliminación más rápida de los PPCPs, así como de dos herbicidas fenilurea, diuron y linuron, y de sus metabolitos más recalcitrantes en los BPSs. Para ello, se ha realizado la búsqueda de microorganismos autóctonos o exógenos resistentes o potencialmente degradadores de estos compuestos. Considerando que los métodos convencionales de bioaumentación usan tecnologías complejas para su aplicación en campo, se ha diseñado una técnica novedosa, sencilla y de bajo coste para incrementar la eficacia de los BPSs mediante la bioaumentación con microorganismos autóctonos, con la ventaja adicional de que se puede realizar a escala de campo. Esta nueva alternativa de bioaumentación se basa en la aplicación de extractos líquidos aireados ricos en microorganismos procedentes de medios previamente expuestos a los contaminantes. Para la obtención de estos extractos serán muy útiles las propias biomezclas que conforman los BPSs que tras un periodo de funcionamiento están envejecidas o agotadas. En cuanto a la bioaumentación con bacterias exógenas, se ha aislado y caracterizado genéticamente una cepa bacteriana capaz de mineralizar ibuprofeno, con el fin de determinar genes implicados en la ruta de degradación de este compuesto. Además, se ha estudiado la supervivencia de esta cepa, así como su desarrollo en diferentes ambientes con el fin de proponer posibles aplicaciones para promover la eliminación de ibuprofeno y/o sus metabolitos de las aguas residuales de forma rápida y eficaz. Esta actividad investigadora se ha reunido en tres capítulos que se comentan a continuación. En el primer capítulo se determinó el potencial de un sistema de biopurificación modelo constituido por una biomezcla compuesta por suelo, vermicompost de alperujo y poda de olivar para degradar ibuprofeno, diclofenaco y triclosan. En estos BPSs construidos a escala microcosmo se aplicaron los contaminantes tanto individualmente como en mezcla a altas concentraciones. De este modo se han podido conocer las interacciones existentes entre los contaminantes y su repercusión en las cinéticas de disipación de cada uno de ellos, así como el posible efecto tóxico de los PPCPs sobre las comunidades indígenas de la biomezcla. Asimismo, se estudiaron e identificaron las comunidades microbianas resistentes a los contaminantes y los principales grupos bacterianos potencialmente involucrados en la degradación de estos PPCPs. Los resultados revelaron que esta biomezcla elimina eficientemente el ibuprofeno seguido del diclofenaco, mientras que el triclosan requiere un periodo de incubación más largo. Además, la disipación del diclofenaco se ve reducida en presencia de los otros PPCPs. El análisis microscópico de células bacterianas vivas mediante la técnica LIVE/DEAD® puso de manifiesto que el triclosan causó un impacto negativo inicial sobre la viabilidad bacteriana. No obstante, este efecto fue mitigado cuando los PPCPs se aplican simultáneamente. Los análisis estadísticos realizados revelaron que las comunidades bacterianas de los microcosmos se ven afectadas principalmente por el tiempo de incubación más que por los PPCPs aplicados. Sin embargo, estos contaminantes afectaron de manera diferente la composición y abundancia relativa de los taxones bacterianos. Tanto el ibuprofeno como el diclofenaco inicialmente aumentaron la diversidad y riqueza bacteriana, mientras que la exposición a triclosan generalmente provocó un efecto opuesto, sin una recuperación completa al final del período de incubación. El triclosan fue el compuesto que causó un mayor impacto en las comunidades bacterianas, afectando negativamente la abundancia relativa de Acidobacteria, Methylophilales y Legionellales. Por último, se buscaron biomarcadores consistentes en unidades taxonómicas operacionales (OTU-Operational Taxonomic Unit) predominantes a altas concentraciones de PPCPs y que, por lo tanto, probablemente alberguen mecanismos de degradación y / o desintoxicación. En el segundo capítulo se ensaya por primera una técnica de bioaumentación sencilla y de bajo coste para acelerar la degradación de contaminantes orgánicos y facilitar su aplicación a escala de campo. Esta técnica consiste en la aplicación de extractos líquidos aireados ricos en microorganismos, generados a partir de distintos tipos de biomezclas previamente expuestas a los contaminantes. El potencial de degradación de estos extractos se ensaya tanto en sistemas acuosos como en los BPSs. El primer estudio de bioaumentación basado en estos extractos se orienta a acelerar la eliminación de pesticidas. Para ello, se emplean biomezclas constituidas por residuos agroindustriales de la producción de aceite de oliva procedentes de estudios anteriores realizados a escala piloto y, por tanto, ya aclimatadas a estos contaminantes. Los resultados obtenidos demuestran que los extractos están enriquecidos en poblaciones microbianas que mejoran la eliminación de los herbicidas fenilurea, diuron y linuron, usados como compuestos modelo, así como de su metabolito más recalcitrante y tóxico, la 3,4-dicloroanilina. De los extractos ensayados, el más efectivo proviene de una biomezcla compuesta por vermicompost de alperujo. El análisis de las comunidades bacterianas enriquecidas tras cinco meses de incubación de esta biomezcla con los contaminantes y de su correspondiente extracto, permitió discriminar grupos de microorganismos potencialmente implicados en la degradación de estos herbicidas. En la biomezcla, se observó un incremento en la abundancia relativa de los taxones Chloroflexi, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Firmicutes, Deinococcus-Thermus y Proteobacteria tras la aplicación de pesticidas. En el extracto correspondiente de esta biomezcla se observa un enriquecimiento de los géneros Dokdonella y Pseudomonas. El segundo estudio de bioaumentación con extractos líquidos aireados se enfoca a la eliminación de PPCPs. Con este fin, se llevó a cabo una aclimatación de la biomezcla de vermicompost de alperujo con los PPCPs para enriquecerla en microorganismos degradadores autóctonos. Seguidamente se comprobó la eficacia del extracto líquido aireado procedente de esta biomezcla para acelerar la eliminación de estos contaminantes y de sus principales productos de degradación. Los resultados mostraron que este extracto mejora la degradación del diclofenaco y del triclosan en los BPSs que son relativamente más persistentes en la biomezcla, así como del ibuprofeno en sistemas acuosos contaminados, y además evita la acumulación de metabolitos secundarios como el metil-triclosan y metabolitos hidroxilados del ibuprofeno. El análisis de las poblaciones microbianas permitió conocer los cambios poblacionales ocurridos en la biomezcla tras la aclimatación con los PPCPs y en el extracto líquido a fin de identificar los grupos resistentes y potencialmente involucrados en la mejora de la degradación de estos contaminantes. Los OTUs más dominantes detectados en el extracto pertenecieron a los grupos taxonómicos Flavobacterium, Thermomicrobia, Nonomuraea y Fluviicola. El tercer capítulo está enfocado a la búsqueda de microorganismos exógenos con capacidad de degradar o resistir altas concentraciones de PPCPs a fin de utilizarlos para incrementar la eliminación de estos contaminantes emergentes tanto en los BPSs como en efluentes secundarios de plantas de tratamiento de aguas residuales. Para ello se llevaron a cabo enriquecimientos a partir de sedimentos del río Elba (Hamburgo, Alemania) expuestos a vertidos de contaminantes procedentes de la industria farmacéutica. En un primer estudio se aislaron y secuenciaron 5 cepas tolerantes a altas concentraciones de diclofenaco. Una de estas cepas pertenece al género Achromobacter y las otras cuatro al género Pseudomonas. Seguidamente, en un segundo estudio, se aisló una cepa capaz de utilizar ibuprofeno como única fuente de carbono y energía que se identificó como Sphingopyxis granuli RW412. El análisis genómico reveló que alberga genes con una similitud muy alta con los genes ipf, implicados en la ruta degradación de ibuprofeno propuesta por Murdoch and Hay (2013). Para confirmar que RW412 degrada ibuprofeno mediante dicha ruta e identificar los metabolitos intermediarios producidos, se purificó la proteína IpfF que inicia la unión específica de coenzima A (CoA) al ibuprofeno generándose ibuprofenil-CoA. Este complejo se identificó por primera vez en este estudio mediante la técnica LC-MS. Este hallazgo, permite demostrar el primer paso en la ruta de degradación del ibuprofeno que se predice en la bibliografía existente. Asimismo, se determinó e identifico otro metabolito intermediario del proceso de degradación mediante las técnicas LC-MS y RMN, el 4-isobutilcatecol confirmando, por primera vez, que su estructura presenta grupos hidroxilo en las posiciones 1 y 2, lo que facilita la acción de extradiol dioxigenasas para su completa mineralización. Por último, en este capítulo se han desarrollado distintos ensayos de bioaumentación con esta cepa exógena con el propósito de mostrar su potencial para acelerar la descontaminación del ibuprofeno tanto en sistemas de biopurificación como en efluentes secundarios. Los resultados obtenidos mostraron que la inoculación de la cepa RW412 aceleró la disipación de este contaminante en los BPSs evitando la acumulación de metabolitos hidroxilados y carboxilados del ibuprofeno. Asimismo, esta cepa fue capaz de eliminar el ibuprofeno mucho más rápido que la propia comunidad bacteriana autóctona que habita los efluentes secundarios procedentes de la planta de tratamiento (EDAR, Granada), eliminando el 100% de este contaminante en un sólo día, lo que indica que esta cepa posee un alto potencial de degradación para el ibuprofeno en estos efluentes. Bibliografía: Castillo, M.D.P., Torstensson, L., Stenström, J., 2008. Biobeds for environmental protection from pesticide use - A review. J. Agric. 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