Diseño y síntesis de nuevos derivados de purinas y de 1,2-ciclohexanodiaminas como agentes antitumorales/ new purine and 1,2-cyclohexanediamine derivatives as antitumour agents

Resumen

RESUMEN El cáncer es la principal causa de muerte a escala mundial, siendo responsable de 7.6 millones de defunciones en 2008. Se prevé que las muertes sigan aumentando y alcancen la cifra de 13.1 millones en 2030. Datos escalofriantes que también afectan a los países en vías de desarrollo donde el cáncer está aumentando en los últimos años [1]. En España, se estima que la mortalidad por cáncer en este año 2013 es cercana a 41.000 en mujeres y 62.000 en hombres, lo que supone 103.000 defunciones en total. La cifra de mortalidad ha aumentado en 4.000 en 2012 con respecto a 2006, afectando este aumento principalmente a las mujeres [2]. La terapia oncológica actual se sigue basando en la cirugía, radioterapia y quimioterapia en general. Este tratamiento carece de la especificidad necesaria para destruir las células cancerosas sin ocasionar graves efectos colaterales. La investigación ha conducido a un avance notable en la compresión de las bases celulares y moleculares del cáncer, lo que permite profundizar en el diseño de nuevos agentes antitumorales más específicos y seguros para el paciente. Este avance en el conocimiento científico del cáncer junto con el desarrollo de la multirresistencia a fármacos en los tratamientos oncológicos justifican la búsqueda y necesidad de nuevos modelos químicos útiles como agentes antiproliferativos. El objetivo fundamental de esta Tesis Doctoral es el desarrollo de nuevas moléculas que inhiban la proliferación celular sin causar graves efectos secundarios en el futuro como tratamiento antitumoral, cuando se ensayen en organismos vivos. Para ello se ha realizado el diseño, síntesis, caracterización y análisis de la actividad biológica de tres familias de fármacos antitumorales con diversidad estructural. Concretamente, se han obtenido veintisiete compuestos finales englobados en 3 familias: A, que incluye 10 derivados de p-nitrobencensulfonilo y 4 derivados de dansilo con una molécula de purina o 5-FU en su estructura; B, formada por 6 derivados de purina y 2 de 5-FU fusionados a acetato de etilo y C, que presenta 5 derivados de 1,2-ciclohexanodiamina. Todas las moléculas se han ensayado frente a las líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano MCF-7, cáncer colorrectal HCT-116, y melanoma humano A375 y G361. Se han realizado estudios de ciclo celular y apoptosis en compuestos seleccionados. Además, se ha elegido el agente antiproliferativo más potente de la familia A para llevar a cabo ensayos de toxicidad y distribución in vivo. Los compuestos más activos de la familia A en todas las líneas celulares son los derivados de bromo, cloro y dicloropurina frente a los derivados de adenina y 5-fluoroacilo, presentando mayor potencia frente a la línea tumoral A375. El compuesto que ha presentado mejor actividad antiproliferativa ha sido el derivado de dicloropurina con una CI50 de 134 nM frente a la línea celular A375. Los compuestos más apoptóticos de la familia A son los derivados de purina, que detienen el ciclo celular en fase G2/M, siendo el derivado con bromopurina en su estructura el derivado que presenta mayores valores de apoptosis total publicado hasta la fecha por el grupo de investigación. Se ha comprobado que el derivado de dicloropurina y su análogo fluorescente no provocan toxicidad en ratones tratados con una dosis de hasta 250 mg/Kg durante 1 semana de tratamiento. Los estudios de distribución del fármaco in vivo revelan que el compuesto fluorescente es absorbido por vía oral y que se distribuye por todo el organismo, siendo el hígado y los riñones los órganos donde más se acumula. Los derivados de la familia B que presentan en su estructura un resto de dicloropurina han resultado tener mayor efecto antiproliferativo que el resto de derivados, siendo este efecto mayor frente a la línea A375. Los isómeros N-9 presentan una mayor actividad que sus correspondientes isómeros N-7, a excepción de los derivados de cloropurina frente a las líneas A375 y G361. Se han obtenido dos ecuaciones QSAR que relacionan la actividad antiproliferativa de los compuestos de esta familia frente a las líneas celulares A375 y G361 y el parámetro lipofílico (log P) de las moléculas. El derivado N-9 de 2,6-dicloropurina es el que tiene mayor capacidad apoptótica en la línea celular A375, no mostrando modificaciones en el ciclo celular en esta línea. Su isómero N-7 detiene el ciclo celular en fase G2/M en la línea celular HCT-116 y en fase G0/G1 en A375 acompañado de altos niveles de apoptosis. Las estructuras que han demostrado mayor potencia antiproliferativa pertenecen a la familia C. El compuesto más activo como agente antiproliferativo frente a la línea celular A375 ha presentado una CI50 de 58 nM. En esta familia de derivados, ni la introducción del grupo p-nitrobencensulfonamido ni el cierre de la molécula favorece el efecto antiproliferativo. Tres de estos compuestos detienen el ciclo celular en fase G0/G1 en la línea celular A375 tanto a 24 como a 48 h de tratamiento, mientras que dos derivados lo detienen en fase S, por lo que dichos compuestos deben actuar sobre diferentes dianas moleculares como agentes antiproliferativos. El compuesto macrocíclico de la familia presenta una capacidad apóptotica máxima tras 48 h de tratamiento de 95 % de apoptosis total frente al 7.65 % del control en la línea tumoral de melanoma A375. Bibliografía 1. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011, 61 (2), 69-90. 2. Sánchez MJ, Payer T, De Angelis R, Larrañaga N, Capocaccia R, Martínez C. Cancer incidence and mortality in Spain: estimates and projections for the period 1981-2012. Ann Oncol 2010, 21 (3), 30-36. SUMMARY Cancer is the leading cause of death worldwide accounting for 7.6 million deaths in 2008.Deaths from cancer worldwide are expected to continue to rise to over 13.1 million in 2030. Cancer is also increasing in developing countries in the last years [1]. The number of total cancer deaths in Spain in 2013 was estimated at around 41,000 in women and 62,000 in men. From 2006 to 2012, the total mortality data show an increase of 4,000 death with a greater number of those of women [2]. Cancer treatment usually consists of surgery in combination with radiotherapy and/or chemotherapy. This treatment lacks the specificity needed to destroy tumour cells without causing several adverse effects. Research has increased the understanding of the cell and the molecular biology of cancer. It allows the development of more specific antiproliferative drugs and subsequently greater safety for the patient. The better knowledge of cancer and the development of multidrug resistance to chemotherapy remain a major challenge in the treatment of cancer. The main aim of this PhD dissertation is to develop new antitumour agents that inhibit proliferation without causing adverse effects. Herein we report the design, synthesis, characterization and biological evaluation of three different families of compounds as potential anticancer drugs. Twenty seven target compounds have been designed, synthesised and characterized. They are included in three families: A, incorporating ten p-nitrobenzenesulfonyl derivatives and four dansyl derivatives with purine and 5-FU moieties in their structures; B, containing six purine derivatives and two 5-FU derivatives linked to ethyl acetate and C with five 1,2-diaminocyclohexane derivatives. All the molecules have been assayed against the human breast cancer cell line MCF-7, human colon carcinoma cell line HCT-116 and the human malignant melanoma cell lines A375 and G361. Apoptosis and cell cycle studies have been also carried out for all the compounds of family B against the MCF-7, HCT-116 and A375 cell lines, and in vivo studies for two compounds of the family A. The bromo, chloro and dichloropurine derivatives of family A show better antiproliferative activities against all the assayed cell lines than the adenine and 5-FU derivatives. The antiproliferative activities of adenine N-3 isomer are slightly better than those of its N-9 isomer. The dichloropurine derivative is the most active compound as an antiproliferative agent with an IC50 of 134 nM against the A375 cell line. The most apoptotic compounds are the purine derivatives and they provoked a G2/M cell cycle arrest. The bromopurine derivative is the most potent inducer of apoptosis so far reported by the research group. It has been demonstrated that the dichloropurine derivative and its fluorescent analogue are nontoxic to BALB/c mice even at the highest bolus dose of 250 mg/kg after 2 weeks. All 40 treated mice remain healthy throughout the 14-day observation period with no evidence of morbidity. Drug distribution studies in vivo have revealed that the fluorescent N-9 dichloropurine derivative is absorbed by the oral route of administration with systemic distribution. Furthermore the drug accumulates mainly in liver and kidney, the organs associated to drug metabolism and excretion respectively. The dichloropurine derivatives of family B have been more active as antiproliferative agents than the rest of the derivatives, showing better IC50 values against A375 cell line. N-9 purine derivatives present a higher antiproliferative activity than that of their N-7 regioisomers except in the case of chloropurine derivatives. In these two compounds, the tendency is reversed against the MCF-7 and HCT-116 cell lines and both regioisomers are equally potent in inhibiting both melanoma cancer cell growths. Two QSAR equations have been obtained between the antiproliferative IC50 values for the compounds and the clog P against the melanoma cell lines A375 and G361. N-9 dichloropurine derivative has been the most apoptotic compound against the A375 melanoma cell line, where no modification in the cell cycle is found. However, its regioisomer gathers cells at the G2/M and G0/G1 phases respectively in the colon and melanoma cancer cells accompanied by high levels of programmed death cell. Family C molecules are the most active compounds as antiproliferative agents against all the assayed cell lines. The most active one presents an IC50 value of 58 nM against the A375 cell line. The introduction of the p-nitrobenzenesulfonyl group, besides the macrocyclization do not improve the antiproliferative activities of the 1,2-diaminocyclohexanes. The p-nitrobenzenesulfonyl derivatives and the macrocycle provoked a G0/G1 cell cycle arrest in A375 cell line at 24 and 48 h of treatment whereas the other two 1,2-diaminocyclohexane derivatives provoked a S phase arrest. The macrocycle obtained presents a very significant apoptotic index of 95 % after 48 h of treatment in the A375 human melanoma cell line. References 1. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011, 61 (2), 69-90. 2. Sánchez MJ, Payer T, De Angelis R, Larrañaga N, Capocaccia R, Martínez C. Cancer incidence and mortality in Spain: estimates and projections for the period 1981-2012. Ann Oncol 2010, 21 (3), 30-36.