Dinámica y compartimentación subnuclear de genes regulados en el desarrollo en trypanosoma brucei

Resumen

En esta tesis se ha realizado un estudio sobre la relación entre arquitectura nuclear y regulación de la expresión de proteínas de superficie durante el ciclo de vida de T. Brucei. La puesta a punto del marcaje de cromosomas con la proteína verde fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein) junto a la aplicación de microscopia óptica por deconvolución nos ha permitido el análisis de las posiciones de los loci transcritos por la pol I respecto a distintos compartimentos subnucleares dependiendo de su estado transcripcional, de la fase del ciclo celular y el estadio en el desarrollo del parásito. Posteriormente mediante el uso de interferencia de RNA se ha llevado a cabo el estudio de la función de proteínas candidatas a ser reguladores de la expresión monoalélica. Tras el descubrimiento de que el VSG-ES activo está asociado de manera exclusiva al ESB (Navarro and Gull 2001) se hace necesario, para comprender la transcripción pol I de genes que codifican proteínas, el análisis de la posición subnuclear del locus prociclina en la forma procíclica del parásito. Los resultados obtenidos durante esta tesis muestran que los genes prociclina expresados de manera multialélica en la forma procíclica del parásito se localizan en el borde del nucleolo. La posición del locus prociclina es similar a la del DNA ribosomal y la actividad transcripcional de la pol I, lo que sugiere que, la periferia del nucleolo es el único subcompartimento en cual se lleva a cabo transcripción pol I en la forma procíclica del parásito. Durante la diferenciación de la forma sanguínea a al forma procíclica la actividad transcripcional del VSG-ES activo disminuye (Blundell et al. 1998; Amiguet-Vercher et al. 2004). Los resultados obtenidos durante esta tesis muestran que dicha bajada en la actividad transcripcional se correlaciona con el reposicionamiento rápido y selectivo del promotor del VSG-ES activo a la envoltura nuclear seguido de una disminución en la accesibilidad del LacR-GFP (Lactose Represor-GFP) a los operadores de la lactosa insertos en dicho VSG-ES. Estos datos sugieren que el silenciamiento del VSG-ES activo está mediado por un reposicionamiento temporal y selectivo en la envoltura nuclear seguido de remodelación de la cromatina. Una cuestión crucial para entender el correcto funcionamiento de la variación antigénica es cómo el estado transcripcional del VSG-ES activo se hereda de una generación a la siguiente en la forma sanguínea del parásito (Borst 2002). El análisis llevado a cabo en esta tesis sobre la dinámica de la maquinaria pol I y loci transcritos por ella durante el ciclo celular muestra que, durante fase S, el ESB no se duplica como estructura citológicamente detectable y el VSG-ES activo asociado con el ESB se reposiciona a una posición subnuclear separado de otros loci transcritos por pol I. Tras la progresión en el ciclo celular, el VSG-ES activo muestra un retraso en la separación de sus cromátidas hermanas las cuales permanecen asociadas al único ESB presente en el núcleo hasta la segregación de los cromosomas. Dicho retraso es dependiente del complejo cohesina y es importante para la herencia de la expresión monoalélica ya que la depleción parcial de la subunidad del complejo cohesina TbSCC1 da lugar a la separación prematura de las cromátidas hermanas del VSG-ES activo y al cambio transcripcional a un VSG-ES previamente inactivo. Proponemos un modelo en el cual el complejo cohesina cumple la función de asegurar la herencia del estado transcripcional activo de un único VSG-ES mediante la formación de un complejo compuesto por las dos cromátidas del VSG-ES activo asociadas a un único ESB hasta la segregación de los cromosomas. Bibliografía Amiguet-Vercher, A., D. Perez-Morga, A. Pays, P. Poelvorrde, H. Van Xong, P. Tebai, L. Vanhamme, and E. Pays. 2004. Loss of the mono-allelic control of the VSG expression sites during the development of Trypanosoma brucei in the bloodstream. Mol Microbiol 51: 1577-88. Blundell, P.A., F. van Leeuwen, R. Brun, and P. Borst. 1998. Changes in expression site control and DNA modification in Trypanosoma brucei during differentiation of the bloodstream form to the procyclic form. Mol Biochem Parasitol 93: 115-30. Borst, P. 2002. Antigenic variation and allelic exclusion. Cell 109: 5-8. Navarro, M. and K. Gull. 2001. A pol I transcriptional body associated with VSG mono-allelic expression in Trypanosoma brucei. Nature 414: 759-63.