Estudio de la diversidad procariótica y caracterización taxonómica y funcional de las bacterias asociadas a la raíz de roble melojo (Quercus Pyrenaica Willd.) y de leguminosas forrajeras del espacio natural de Sierra Nevada

Resumen

Los servicios ecosistémicos asociados a los bosques son incuestionables, contribuyendo en gran medida tanto al bienestar social (proporcionando importantes productos de mercado), como a la regulación de numerosos procesos ecológicos (bienes intangibles) (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). Pese a su importancia a escala global, los biomas forestales se encuentran fuertemente amenazados por el cambio climático y los cambios en la gestión y uso del suelo. Así, el Espacio Natural de Sierra Nevada, en el sureste de la Península Ibérica, es un enclave en el que las previsiones sobre el incremento de las temperaturas, el descenso de las precipitaciones anuales, y el aumento de la frecuencia e intensidad de los incendios forestales, resultan especialmente preocupantes (Pausas, 2004; Zamora et al., 2015). Una de las especies leñosas sobre la cual es notorio el impacto del cambio climático y del cambio de gestión de sus masas, es Quercus pyrenaica Willd. (roble melojo). Sus bosques se encuentran en la actualidad considerablemente degradados y fragmentados, siendo igualmente alarmante su escaso vigor vegetativo (Nieto Quintano et al., 2016). Así pues, urge el desarrollo de estrategias silvícolas que permitan mejorar el estado de debilitamiento de los melojares nevadenses. En este contexto, es conocido el importante papel que las bacterias desempeñan en los ecosistemas forestales, participando en los ciclos biogeoquímicos de los elementos y contribuyendo al mejor estado general de salud de las plantas mediante diversos mecanismos, como la mejora de la biodisponibilidad de ciertos nutrientes y la protección de sus hospedadores frente a organismos fitopatógenos (Glick, 2012; Lladó et al., 2017). En este trabajo se han caracterizado – a nivel genotípico, taxonómico, funcional o enzimático, según el caso – las bacterias asociadas a la raíz de plantas leguminosas silvestres y de roble melojo, al objeto de poder llevar a cabo en un futuro tareas de prevención de incendios y de mejora de las masas boscosas del Espacio Natural de Sierra Nevada. En primer lugar, se caracterizaron las bacterias aisladas del interior de los nódulos de las leguminosas Lathyrus cicera, L. intrincatus, Vicia sativa subsp. angustifolia, V. disperma, Trifolium glomeratum y T. cherleri, al objeto de poder mejorar la calidad de dichas especies que forman parte de la flora forrajera naturalmente presente en Sierra Nevada. El genotipado de 205 aislados reveló la gran diversidad genotípica de mismos. A su vez, el análisis taxonómico basado en varios genes cromosómicos permitió clasificar las cepas en estudio en el grupo filogenético de Rhizobium leguminosarum. Sin embargo, ninguna de ellas pudo ser identificada a nivel de especie: si bien algunas cepas podrían considerarse como candidatas a nuevas especies, en otros casos el diverso origen filogenético de las mismas según el gen cromosómico en estudio hizo imposible su identificación. Por el contrario, el análisis del gen de nodulación nodC demostró que las cepas aisladas de Vicia spp. y Lathyrus spp. pertenecen al simbiovar viciae, mientras que aquellas obtenidas de los nódulos de Trifolium correspondieron al simbiovar trifolii. Dichos resultados han sido ya publicados (Villadas et al., 2017) y se recogen en el Capítulo I de la presente memoria de Tesis. De forma previa al desarrollo de bioinoculantes a aplicar sobre un hospedador vegetal concreto, resulta esencial conocer en detalle la comunidad procariota asociada al mismo (Kaminsky et al., 2019). La pirosecuenciación de amplicones correspondientes al gen rrs así como del ds-cDNA derivado de sus transcritos permitió llevar a cabo un estudio detallado sobre la composición y estructura de las comunidades procariotas totales y potencialmente activas, respectivamente, que habitan la rizosfera de roble melojo. Los resultados obtenidos revelaron que el core procarioma total y potencialmente activo se encuentra definido por un número relativamente bajo de OTUs que dominan la rizosfera de roble melojo. Mediante la comparación de ambos tipos de poblaciones fue posible además determinar que ciertos OTUs pertenecientes a los géneros Phenylobacterium y Pseudomonas, entre otros, podrían encontrarse sintetizando activamente ribosomas aun encontrándose en baja abundancia en el suelo rizosférico. Así, los resultados incluidos en el Capítulo II y publicados recientemente (Lasa et al., 2019a) sugieren que los mencionados OTUs podrían ser influyentes en el hábitat en estudio. Una vez conocida la composición del procarioma rizosférico, se realizaron diferentes análisis (mediante secuenciación masiva con Illumina) con los que se pretendió conocer si las comunidades procariotas de la rizosfera de robles inoculados y no inoculados en vivero con un consorcio bacteriano, previamente obtenido por el grupo de investigación, son diferentes tras año y medio de su trasplante a campo. La comparación de los índices diversidad α, estructura, perfiles taxonómicos y de las posibles funciones desempeñadas por los miembros de ambas comunidades procariotas permitió confirmar que no existen diferencias entre las poblaciones de robles inoculados y control, a ninguno de los niveles estudiados (Capítulo III). Dado que la inoculación bacteriana aparentemente no resultó en una alteración de las comunidades procariotas, se procedió a la búsqueda en el entorno radicular de roble melojo de posibles candidatos bacterianos a bioinoculantes, en base a los resultados obtenidos en el Capítulo II. Inicialmente, a partir de la rizosfera de roble melojo se aislaron 44 cepas pertenecientes al género Pseudomonas genotípicamente diversas, de las cuales algunas podrían pertenecer a la especie P. lactis y otras a hasta cinco nuevas especies. Por otro lado, de la endosfera radicular se aislaron 17 cepas cuya identificación taxonómica reveló que todas pertenecían al género Luteibacter, y con alta probabilidad a la especie L. rhizovicinus (Capítulo IV). Finalmente, se procedió a la caracterización funcional de las 61 cepas aisladas del entorno radicular de roble melojo, para lo cual se estudió en primera instancia el potencial rol de las mismas en la descomposición de la materia orgánica. Mediante la realización de ensayos fluorimétricos se estudió la actividad de 12 enzimas hidrolíticos extracelulares, analizando la actividad de los mismos en asociación a la pared celular bacteriana, y cuando estos son excretados al medio extracelular. Así, en el caso de las cepas pertenecientes al género Luteibacter pudo apreciarse que gran parte de la actividad total de la mayoría de los enzimas se atribuye a la fracción celular, siendo la estrategia de utilización de enzimas de las cepas del género Pseudomonas variable y dependiente del enzima considerado. Teniendo en cuenta la actividad detectada en ambas fracciones, fue posible determinar que las cepas pertenecientes al género Luteibacter son capaces de producir un amplio rango de polisacarasas (celulasas, diversos tipos de hemicelulasas y quitinasa), así como fosfata ácida y lipasa. En el caso de las cepas adscritas al género Pseudomonas, la producción y actividad de los enzimas hidrolíticos estudiados resultó más modesta, siendo 15 el número promedio de enzimas producidos. Nuevamente, la lipasa y la fosfatasa ácida fueron los enzimas producidos por mayor número de cepas del género Pseudomonas y aquellos para los que se detectó un mayor nivel de actividad. Así, los resultados de los ensayos enzimáticos (correspondientes al Capítulo V y ya publicados, Lasa et al., 2019b) demostraron que las bacterias analizadas aisladas de la rizosfera y endosfera radicular de roble melojo podrían contribuir, en diferente medida, a la degradación de la materia orgánica. Ello a su vez implica que podrían participar activamente en los ciclos del carbono (C), nitrógeno (N) y fósforo (P), procesos clave en los ecosistemas forestales (Lladó et al., 2017). La caracterización funcional culminó con la evaluación in vitro de varias propiedades asociadas a la promoción directa e indirecta del crecimiento vegetal. Así, el potencial efecto beneficioso de las bacterias en estudio sobre el desarrollo vegetal quedó reflejado en la capacidad de 18, 22, 31, 38, 39 y 40 cepas del género Pseudomonas de producir proteasas, compuestos indólicos, solubilizar Ca3(HPO4)2, producir endocelulasas, solubilizar CaHPO4 y sintetizar sideróforos. A su vez, todas fueron capaces de expresar catalasa y tolerar ácido tánico, siendo dos de ellas capaces de inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos que afectan a quercíneas (Biscogniauxia mediterranea, Diplodia corticola, Armillaria mellea). Asimismo, todas las cepas del género Luteibacter mostraron habilidad de producir sideróforos, catalasa, compuestos indólicos, endocelulasas y dos de ellas de sintetizar proteasas. En última instancia el efecto promotor del crecimiento vegetal fue demostrado mediante ensayos in planta sobre Medicago sativa (alfalfa) para 12 de las cepas en estudio, si bien este no pudo ser observado sobre quercíneas, ni tan siquiera sobre plántulas de Q. pyrenaica (Capítulo VI). Teniendo en consideración los resultados obtenidos en este trabajo, es posible concluir que el Espacio Natural de Sierra Nevada – y en concreto el nicho radicular de plantas leguminosas forrajeras y de la leñosa Q. pyrenaica – constituye un excelente reservorio de diversidad bacteriana a diferentes niveles. En dicho hábitat es posible encontrar bacterias con potencial promotor del crecimiento vegetal (directo e indirecto), y con un posible marcado papel en el ciclo de ciertos elementos como el C, P y N. La utilización como bioinoculantes de plantones de roble melojo con los que llevar a cabo tareas de repoblación se presenta como una herramienta de bajo impacto ecológico y prometedora en el ámbito de la silvicultura integrada, siendo aún necesario profundizar en ciertos aspectos en el futuro.   SUMMARY The ecosystem services associated with forests are very valuable, since they contribute to society’s welfare to a great extent (for example, by providing important market products), and especially to the regulation of numerous ecological processes (intangible goods) (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). In spite of their worldwide significance, forest biomes are strongly threatened by climate change and land use and management changes. Therefore, the predicted rise in temperatures, decrease in annual rainfall levels and the consequent increase in the frequency and intensity of forest fires, are especially worrying in the Natural Space of Sierra Nevada, in the southeast of the Iberian Peninsula (Pausas, 2004; Zamora et al., 2015). Quercus pyrenaica Willd. (also known as melojo oak) is one the woody species which is markedly affected by the change in the management of its forests and by climate change. Its forests show an advanced state of deterioration and fragmentation, thus the vegetative vigour of this species is currently considered extremely worrying (Nieto Quintano et al., 2016). Therefore, it is imperative to develop silvicultural strategies in order to improve the overall weakening state of melojo oak forests located in Sierra Nevada. In this sense, it is already well known the essential role that bacteria usually play in forest ecosystems. Bacteria intervene in important processes related to biogeochemical cycles, also being able to contribute to the general plant fitness through diverse mechanisms, namely by improving the bioavailability of several nutrients and by protecting their plant host against phytopathogenic organisms (Glick, 2012; Lladó et al., 2017). In this work, we characterised those bacteria associated with the roots of wild forage leguminous plants and melojo oak – in a genotypic, taxonomic, functional or enzymatic way, depending on the case – , in order to develop in the near future forest fire prevention tasks and strategies to improve the state of the forests in the Natural Space of Sierra Nevada. Firstly, those bacteria inhabiting roots nodules of the leguminous plants Lathyrus cicera, L. intrincatus, Vicia sativa subsp. angustifolia, V. disperma, Trifolium glomeratum and T. cherleri were characterised with the aim of improving the quality of that forage species naturally growing in Sierra Nevada. The fingerprinting profiles of the 205 bacterial isolates obtained from nodules revealed that those plant species’ endosymbionts are genotipically very diverse. The taxonomic analysis based on four chromosomic genes showed that all the selected strains belonged to the Rhizobium leguminosarum phylogenetic group. Nevertheless, none of them could be classified into any described species of genus Rhizobium. Some strains could belong to novel undescribed species, while the different phylogenetic origin of several strains depending on the considered gene did not allow their classification. On the other hand, the analysis of the nodulation nodC gene revealed that all the strains isolated from Vicia spp. and Lathyrus spp. nodules belonged to symbiovar viciae, and those nodulating Trifolium spp. corresponded to symbiovar trifolii. All these results have already been published (Villadas et al., 2017) and are included in Chapter I of this Doctoral dissertation. In order to develop a new bioinoculant to be applied to a specific plant host, it is fundamental to analyse in detail the autochthonous prokaryotic community associated to the mentioned host (Kaminsky et al., 2019). Through the pyrosequencing of rrs gene amplicons, as well as the ds-cDNA derived from its transcripts, the structure and composition of the total and potentially active prokaryotic communities dwelling in the rhizosphere of melojo oak was respectively analysed. The obtained results revealed that both total and potentially active core procariomes were dominated by a relatively small number of OTUs highly abundant. When both populations were compared, we found that several OTUs belonging to Phenylobacterium and Pseudomonas, among other genera, could be synthesising ribosomes actively in spite of their scarce relative abundance in melojo oak’s rhizosphere. Therefore, it suggests that the mentioned OTUs may have influence on the considered ecological niche. These results are presented in Chapter II and have already been published (Lasa et al., 2019a). Once the composition and structure of melojo oak’s rhizospheric communities were described, further ecological analyses were accomplished by Illumina deep sequencing, with the aim of determining whether the prokaryotic communities of non-inoculated and inoculated melojo oak trees with a bacterial consortium, previously obtained by our research group, were different one year and a half after their transplantation. The comparison of α diversity indices, structure, taxonomical profiles and potential functions performed by prokaryotic members of both communities showed that there were no statistically significant differences between the populations of inoculated and non-inoculates trees, at any of the studied levels (Chapter III). Given that bacterial inoculation apparently did not alter melojo oak’s prokaryotic communities, we sought autochthonous bacteria associated with melojo oak’s roots showing plant growth promoting abilities, in order to develop bacterial bioinoculants in the future. On the one hand, we isolated 44 rhizospheric strains belonging to genus Pseudomonas, which were genotipically diverse. Some of them belonged to the species P. lactis, while others could be affiliated with even five novel species of this genus. On the other hand, 17 isolates were obtained from Q. pyrenaica’s root endosphere, all of them belonging to genus Luteibacter, probably to species L. rhizovicinus (Chapter IV). Finally, the 61 root-associated bacterial strains were functionally characterised. The ability of the strains to enzymatically decompose plant and fungal biomass was assayed through fluorimetric assays. Specifically, the enzyme deployment strategy of the strains was evaluated by exploring the activity of cell wall-attached and freely-released hydrolytic enzymes. In the case of the strains belonging to genus Luteibacter, cell-bound enzymes accounted for most of the total enzymatic activity, whereas the enzyme deployment strategy of Pseudomonas strains differed depending on the enzyme considered. Taking heed of the enzymatic activity recorded in both cell-bound and cell-free fractions, it was possible to determine that the strains isolated from root endosphere were able to synthesise a wide range of polysaccharases (cellulases, different types of hemicellulases, and chitinase), in addition to acid phosphatase and lipase. The spectrum of the enzymes produced and the titers of activity were more modest in the case of genus Pseudomonas, whose strains expressed 15 enzymes on average. As in the case of genus Luteibacter, acid phosphatase and lipase were the enzymes synthesised by all the strains, and those for which the highest activity levels were recorded. Therefore, the results concerning the enzymatic assays (Chapter V and already published, Lasa et al., 2019b) demonstrated that those studied bacteria associated with melojo oak roots could be involved in the organic matter decomposition to a different extent. It also suggests that these strains may contribute to carbon (C), nitrogen (N) and phosphorus (P) cycles, essential processes in forest ecosystems (Lladó et al., 2017). The functional characterisation of root-associated strains culminated in in vitro assessments of several direct and indirect plant growth promoting-related traits. In this sense, 18, 22, 31, 38, 39 and 40 strains corresponding to genus Pseudomonas were able to express proteases, indole-related compounds, solubilise Ca3(HPO4)2, produce endocellulases, solubilise CaHPO4 and synthesise siderophores, respectively. In addition, all of the strains were able to produce catalase, tolerate tannic acid, although only two inhibited the growth of several Quercus-affecting phytopathogenic fungi, namely Biscogniauxia mediterranea, Diplodia corticola and Armillaria mellea. In a similar way, those strains belonging to genus Luteibacter showed the ability to produce siderophores, catalase, indole-related compounds, endocellulase and just two of them, to express proteases. The plant growth promoting potential of 12 strains was confirmed on Medicago sativa (alfalfa) plants, while none of the tested strains were able to affect positively Q. pyrenaica’s fitness (Chapter VI). Taking into account all the results obtained along this research work, it is possible to conclude that the Natural Space of Sierra Nevada – and especially root-related ecological niche of wild leguminous plants and woody species such as Q. pyrenaica – is a hotspot of bacterial diversity at different levels. This habitat harbours direct and indirect plant growth promoting abilities-showing bacterial members, which may participate in the turnover of some elements such as C, N, P. In addition, the use of bacterial inoculants on melojo oak plantlets with which carry out afforestation tasks seems to be a strategy with an associated low ecological impact. Therefore, it could represent a promising tool in the context of integrated silviculture, although further analyses should be performed in the future to perfect this technology