Desarrollo y caracterización de nanosistemas magnéticos con potencial biotecnológico

Abstract

Las nanopartículas magnéticas, principalmente las nanopartículas magnéticas de magnetita (Fe3O4), se han posicionado como una plataforma tecnológica muy versátil en el campo de la nanotecnología condicionadas por sus propiedades magnéticas, físicas, químicas y biológicas. Dado el creciente interés que dichas nanopartículas han generado en la última década, toda la investigación realizada en presente Tesis Doctoral se encuentra enmarcada en el desarrollo y la caracterización de nanosistemas magnéticos y la evaluación de su aplicación en nanotecnología, especialmente, en el campo de la nanomedicina y la astrobiología. Los resultados experimentales obtenidos durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, se exponen en esta memoria divididos en un total de 4 capítulos. En el Capítulo I, se aborda el desafío del estudio y diseño de un protocolo de síntesis de nanopartículas de magnetita potencialmente escalable que permita la obtención de nanopartículas magnéticas con un tamaño y morfología determinados (factores condicionantes de las propiedades magnéticas de las nanopartículas), así como la dotación a estas nanopartículas de grupos funcionales en su superficie, características todas ellas indispensables para su posible aplicación en el campo de la nanotecnología. Además, dicha metodología debe cumplir los parámetros de rentabilidad, sostenibilidad y no presentar un impacto significativo en el medio ambiente. Para ello, se plantean dos enfoques diferentes que implican el uso de la aproximación de la química sintética biomimética utilizando el método de síntesis de coprecipitación para la obtención de estas nanopartículas. En el primero de ellos, una vez optimizada la expresión heteróloga y la purificación de la proteína MamC del magnetosoma de la bacteria magnetotáctica (MTB) Magnetococcus marinus MC-1, se expone el estudio de diferentes metodologías de conservación como primer paso hacia el escalado de la síntesis de nanopartículas magnéticas biomiméticas de magnetita mediadas por dicha proteína (BMNPs), las cuales han demostrado tener un gran potencial para su aplicación en nanotecnología. Para ello, se ha evaluado la eficacia de diferentes metodologías de conservación (crioconservación, liofilización y refrigeración) a través del estudio de la conformación y el estado de oligomerización de la proteína conservada mediante el uso de cada una de ellas, así como analizando los cristales obtenidos cuando MamC conservada de manera diferente se introducía en la mezcla de reacción para obtener BMNPs. En este estudio, se ha podido comprobar que, de las diferentes metodologías analizadas, solamente la crioconservación es efectiva para la correcta conservación de la estructura funcional de la proteína y la preservación del estado monomérico activo de la misma. En relación al segundo enfoque abordado, éste se basa en el uso de aminoácidos simples (Lisina y Arginina) como aditivos biológicos para la síntesis química biomimética de nuevos cristales de magnetita. Así, se ha podido comprobar que el aminoácido lisina es capaz de controlar el tamaño de los cristales obtenidos, a diferencia de otros aminoácidos como la arginina que no ejercen efecto sobre el tamaño. Los cristales Lys-MNP obtenidos presentan un tamaño promedio de 30 nm, comportamiento superparamagnético a temperatura ambiente, un gran momento magnético por partícula y una alta saturación de magnetización. Además, dichas nanopartículas exponen carga superficial negativa a pH fisiológico como consecuencia del recubrimiento con lisina, facilitando ésto su posible funcionalización con diferentes moléculas mediante interacciones electrostáticas. De esta manera, en dicho estudio, se ha desarrollado un protocolo rentable y potencialmente escalable para la obtención de nanopartículas híbridas que reúnen las características necesarias para su aplicación en nanotecnología. En el Capítulo II nos centramos en la evaluación y el análisis del uso de las nanopartículas BMNPs, nanopartículas ampliamente caracterizadas por nuestro grupo de investigación, como potenciales nanotransportadores de fármacos en combinación con la aplicación de un tratamiento de hipertermia magnética (agentes de hipertermia). Para ello, se plantean dos pruebas de concepto utilizando dos tipos (modelo) de enfermedades localizadas: cáncer y enfermedades infecciosas. En dichos estudios, se diseña, caracteriza, optimiza y se discute el nanosistema formado por la unión de la molécula a transportar unida a las BMNPs, así como también se evalúa su efecto citotóxico o antibacteriano, el mecanismo de acción y la especificidad in vitro del nanosistema en combinación o no con la aplicación de un campo magnético alterno (AMF). En la primera de ellas, se ha realizado la unión el inhibidor del enzima colina quinasa α1 (ChoKα1), el compuesto Ff35, a las nanopartículas mediante unión electrostática de tipo cooperativo. Por otro lado, los análisis de citotoxicidad y especificidad in vitro, realizados utilizando la línea celular de hepatoblastoma humano HepG2, han probado que dicha unión incrementa la selectividad del fármaco facilitando la internalización del mismo y reduciendo de esta manera su interacción con la captación de colina, así como desencadenan un efecto antiproliferativo. Además, se ha demostrado que el uso combinado de la quimioterapia dirigida junto con la hipertermia magnética incrementa el efecto citotóxico del nanosistema. En la segunda prueba de concepto, se ha realizado la unión del péptido AS-48 a las nanopartículas BMNPs, también mediante unión electrostática de tipo cooperativo y se ha estudiado su efecto antibacteriano, en combinación o no con el tratamiento de hipertermia magnética, frente a cultivos plantónicos de bacterias Gram positivas (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli). El nanosistema presenta un fuerte efecto bactericida en bacterias Gram positivas, así como, sorprendentemente, amplia el espectro de acción del fármaco a bacterias Gram negativas, concretamente, E. coli. Además, este comportamiento bactericida también se observa cuando el nanosistema se aplica en combinación con el tratamiento de hipertermia magnética en P. aeruginosa y K. pneumoniae. Así, los resultados obtenidos han revelado el potencial del nanosistema desarrollado, tanto en combinación o no con el tratamiento de hipertermia magnética, para su posible aplicación en el tratamiento local antibacteriano de infecciones. En el Capítulo III, se aborda el diseño y la caracterización de nuevas nanoformulaciones que comprendan las nanopartículas BMNPs, para explorar su potencial aplicación como sistemas multifuncionales en el tratamiento local de enfermedades localizadas. Para ello, se han realizado un total de tres estudios para el desarrollo de tres nanformulaciones magnéticas diferentes. En el primero de ellos, se expone el desarrollo y la caracterización de una nanoformulación que combina dos tipos de nanopartículas magnéticas (nanopartículas de magnetita inorgánicas –MNPs- y BMNPs) y se evalúa su posible efecto en la mejora de la respuesta de hipertermia magnética de la nanoformulación. En dicho trabajo, se ha demostrado que la mezcla de los dos tipos de nanopartículas, especialmente, aquella mezcla compuesta por 25% BMNPs + 75% MNPs, da lugar a un incremento en la respuesta de hipertermia magnética en comparación con la respuesta observada en las nanoformulaciones formadas por un solo tipo de nanopartícula. En el segundo estudio, continuación de la investigación iniciada en el primero, se plantea el desarrollo de una nanoformulación que combine MNPs y TBM (BMNPs funcionalizadas con doxorrubicina y el anticuerpo monoclonal AR-3) y se evalúa la posible aplicación de este sistema multifuncional como nanotransportador mediante doble guía (anticuerpos monoclonales y orientación magnética) y como agente de hipertermia. Los resultados obtenidos revelan que la nanoformulación compuesta por 25% TBM + 75% MNPs mejora la estabilidad coloidal y la respuesta de hipertermia en comparación con sus contrapartes compuestos por un solo tipo de nanopartícula. Por otro lado, en términos de su eficacia como nanotransportador, la nanoformulación muestra una unión estable del fármaco a pH fisiológico, unión que se debilita en presencia de pH ácido (microambiente tumoral), más aún en combinación con la aplicación de un campo magnético alterno, lo que demuestra la sinergia que existe entre estas dos terapias para aumentar de manera relevante la liberación del fármaco en el sitio diana e incrementar de esta manera el efecto citotóxico in vitro de la nanoformulación en la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29. Por lo tanto, dichos resultados han puesto de manifiesto el potencial de las nanoformulaciones diseñadas para ser dirigidas al sitio diana mediante una doble guía (anticuerpo y orientación magnética) y para actuar como un agente antitumoral de manera bimodal: como agente de hipertermia mediante la aplicación de un AMF y como un nanotransportador para la liberación controlada del fármaco en respuesta a estímulos internos (pH) y externos (incremento de temperatura tras la aplicación del AMF). Por último, el tercer estudio se centra en la mejora de la estabilidad coloidal de las nanopartículas magnéticas (tanto BMNPs como MNPs). Para ello, se plantea el desarrollo de un protocolo de recubrimiento de estas nanopartículas (de manera individual o utilizando las combinaciones caracterizadas en el primer estudio) con una envoltura lipídica para la formación de magnetoliposomas y la evaluación del efecto de esta cubierta tanto en la estabilidad coloidal de la nanoformulación, como en las propiedades magnéticas de la misma, en términos de saturación magnética y respuesta a un AMF. Los magnetoliposomas se formaron mediante la metodología de hidratación del film. Presentaban un tamaño promedio de 100 nm y contenían un bajo número de nanopartículas por liposoma (< 10). Además, se puso de manifiesto que la cubierta lipídica incrementaba la estabilidad coloidal de las nanopartículas sin apantallar de manera significativa sus propiedades magnéticas. Por otro lado, se comprobó que dicha cubierta desaparecía tras la aplicación del AMF, lo que condujo al importante resultado de poder controlar de modo remoto la apertura del magnetoliposoma en el sitio diana mediante la aplicación de estímulos externos (AMF). Finalmente, en el Capítulo IV, se aborda una temática que ha generado una gran controversia y debate en el seno de la comunidad científica en las últimas décadas. En particular, abordamos la definición de una huella biogeoquímica para la identificación de cristales de magnetita con origen abiótico, específicamente, la diferenciación entre magnetosomas y magnetitas de origen inorgánico o biomimético. Esta definición es de una especial relevancia debido a que dichos cristales se pueden utilizar como evidencia de actividad microbiana ligada a la existencia de vida en sedimentos terrestres y extraterrestres, a través del análisis e identificación de magnetofósiles. Con dicho objetivo, se plantea un enfoque que implica el análisis a escala atómica de los tres tipos de magnetita antes indicados utilizando la técnica de tomografía con sonda atómica (APT). En el estudio preliminar realizado, se ha demostrado que los magnetosomas muestran una huella biológica única relacionada con una señal atómica carbono que es significativamente más alta en los magnetosomas en comparación con el resto de los cristales de origen químico (inorgánicos o biomiméticos). Además de proponer esta huella biológica como bioindicador de origen biogénico de muestras naturales, en este trabajo demostramos el potencial de esta la metodología APT para su aplicación en la identificación de magnetofósiles.