Profundización en el estudio de genes relacionados con la síntesis intraplastidial de ácidos grasos en la semilla de girasol en desarrollo

Resumen

Para optimizar el uso del aceite de origen vegetal como fuente de energía renovable, de productos químicos, o para el consumo humano, resulta de interés tanto el aumento del contenido total de aceite en las semillas como la variación de su perfil de ácidos grasos. Por ello, y para conocer mejor el funcionamiento de la maquinaria enzimática que hace posible la biosíntesis de estas macromoléculas, al igual que entender como este entramado de proteínas es regulado tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional, en esta tesis se han abordado los siguientes temas: En primer lugar, se ha llevado a cabo el estudio de los componentes comunes que forman parte del complejo de la Ácido Graso Sintasa, complejo FAS, complejo poco estudiado en plantas pero de gran importancia puesto que lleva a cabo los pasos iniciales de síntesis de novo de ácidos grasos, imprescindibles para la producción de lípidos en la planta. Se han clonado y caracterizado bioquímicamente los genes de Helianthus annuus que codifican para las actividades ß-cetoacil-ACP reductasa (KAR), ß-cetoacil-ACP deshidratasa (HAAD) y enoil-ACP reductasa (ENR), que llevan a cabo los pasos de reducción y deshidratación de acilos en la ruta de síntesis de ácidos grasos. Se han identificado 2 genes para cada actividad enzimática (HaKAR1 y HaKAR2, HaHAAD1 y HaHAAD2, HaENR1 y HaENR2), observándose las menores diferencias entre las secuencias proteicas deducidas de los dos genes HaKAR1 y HaKAR2 (identidad del 98%) y las mayores entre las proteínas deducidas de HaENR1 y HaENR2 (identidad del 75%), localizándose, incluso, en dos grupos filogenéticos diferentes. Los análisis de expresión en girasol de los genes HaHAAD1 y HaENR1 mostraron niveles constitutivos en todos los tejidos, en cambio, los genes HaKAR, HaHAAD2 y HaENR2 presentaron los mayores niveles en la semilla en desarrollo, coincidiendo con la síntesis activa de lípidos de reserva. Todos estos genes, excepto HaKAR2, fueron expresados heterólogamente en Escherichia coli, mostrando una interacción con la maquinaria de la bacteria e implicando la funcionalidad de las mismas, puesto que afectaban la síntesis de ácidos grasos del organismo. Incluso, en el caso de HaENR1 y HaENR2, se llegó a confirmar la complementación del gen bacteriano en estirpes con mutaciones termosensibles para este gen, aunque se observaron diferencias con respecto a la proteína bacteriana. Posteriormente, la caracterización bioquímica de la proteína HaKAR1, purificada heterólogamente, demostró la actividad de la enzima purificada con una Km de 290 µM para acetoacetil-CoA, utilizando solamente como poder reductor NADPH, para el cual presentó una Km de 71,63 µM. Por otro lado, la enzima HaHAAD2, mostró una mayor velocidad de reacción con el sustrato crotonil-CoA que la enzima HaHAAD1, 4,3 µmol/min/mg de proteína frente a 0,26, respectivamente. Finalmente, la enzima HaENR1 mostró mayor actividad específica por crotonil-CoA (Km 119 µM y Vmax de 9,75 µmol/min/mg de proteína) que la enzima HaENR2 (Km 121 µM y Vmax de 2,37 µmol/min/mg de proteína). Para ninguna de las dos enzimas se observó actividad con NADPH como fuente de poder reductor, utilizando sólo el NADH. En segundo lugar, para comprender el mecanismo que hace posible la activación o represión de los genes involucrados en la ruta intraplastidial de biosíntesis de ácidos grasos en el girasol se ha llevado a cabo la clonación de un fragmento de 685 pares de bases de la región promotora del gen HaSAD17 que codifica para una de las estearil-ACP desaturasas de girasol. Posteriormente se comprobó la funcionalidad como promotor de 227 pb de la región reguladora del gen en la planta modelo A. thaliana, el cual fue capaz de activar la expresión del gen marcador gus plus en distintos tejidos de las plantas de Arabidopsis transformadas con la construcción pHaSAD17:GUS, confirmando la implicación de dicha región en la regulación de la expresión del gen SAD17 en la planta de girasol. En el estudio bioinformático de la secuencia de 685 pb se halló un gran número de regiones en cis reconocidas por distintos factores de transcripción que se expresan en semilla en desarrollo, entre los que cabe destacar una caja AW, diana del factor de transcripción WRINKLED1. A partir de semillas en desarrollo de girasol se ha clonado y secuenciado el cDNA de HaWRI1, que codifica para el factor de transcripción WRINKLED1 en girasol. El análisis de la expresión del gen en la planta mostró los mayores niveles en la semilla en desarrollo coincidiendo con el periodo de síntesis activa de ácidos grasos en la planta. La secuencia proteica deducida presentaba dos dominios de unión a DNA APETALA2. Para comprobar la interacción entre este factor de transcripción y el promotor del gen HaSAD17, sería necesario llevar a cabo un estudio in vitro, tal como un gel de retardo y así confirmar la relación física entre ambos componentes.