Fijación y estudio de la línea medio palmítico CAS-7Caracterización de las enzimas intraplastidiales Δ9 y Δ15 desaturasas, y la ferredoxina de girasol (Helianthus annuus L.)

Resumen

Los objetivos de esta Tesis son: I) Identificación y caracterización de los genes que codifican a las estearil-ACP desaturasas en las semillas en desarrollo de girasol (Helianthus annuus L.). - Clonación, secuenciación e identificación de los distintos tipos de estearil-ACP desaturasas, así como su estudio en los distintos mutantes. - Expresión heteróloga en E. coli, purificación y caracterización de las proteínas. II) Fijación y caracterización de la nueva línea mutante de girasol CAS-7. - Estudio del fenotipo de este nuevo mutante. - Efecto de la temperatura en la germinación. - Caracterización analítica de su aceite. III) Caracterización de la linoleato desaturasa plastidial de girasol FAD7. - Clonación y secuenciación de la linoleato desaturasa plastidial de girsasol. - Caracterización funcional usando los sistemas de expresión heteróloga, la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 y la levadura Sacharomyces cerevisiae. IV) Y por último la caracterización del cofactor de ambas desaturasas plastidiales, la ferredoxina de girasol: - Clonación y secuenciación de una ferrredoxina fotosintética de girasol. - Expresión heteróloga en E. coli, purificación y caracterización de esta proteína. CONCLUSIONES: 1. A partir de cDNA de semillas en desarrollo de girasol (Helianthus annuus L.) se han aislado, clonado y secuenciado los genes Hasada y Hasadb que codifican estearil-ACP desaturasas. El estudio de la secuencia de DNA genómico ha permitido la caracterización de 4 genes, dos que codifican para HaSADA y otros dos que codifican para HaSADB. Uno de los genes Hasadb, Hassadb2, codifica para una proteína truncada. Los transcritos de todos estos genes se han detectado en semilla en formación de girasol. 2. El estudio de la secuencia de estos genes en las líneas alto-esteárico de girasol, CAS-3 y CAS-4, han puesto de manifiesto la falta de mutaciones estructurales en HaSADA: la utilización de vectores de baja expresión en E. coli, como el sistema pET, permitió la obtención de la proteína madura HaSADA1 activa en ensayos in vitro. 3. En el caso de HaSADB, existen diferencias en la secuencia del gen Hasadb1, que codifica para la proteína funcional, entre las líneas control y mutantes. Mientras que la diferencia encontrada en el residuo 239, isoleucina en la línea RHA-274 y treonina en las líneas mutantes alto esteárico, parece ser alélica, no se puede descartar totalmente que la sustitución de la arginina 170, implicada en la estabilización del homodimero, por glicina, sea en parte responsable del fenotipo observado. 4. El estudio y caracterización del mutante medio palmítico CAS-7 nos ha permitido concluir que estas plantas presentan una baja acumulación de lípidos de reserva, asemejándose, fenotípicamente, al mutante wrinkle de Arabidopsis. Como consecuencia de esta falta de lípidos de reserva su crecimiento es más lento y se detiene a los 8 días después de la germinación. 5. Las plántulas de la línea CAS-7 no sintetizan ácido linolénico cloroplástico, necesario para hacer la fotosíntesis, debido a la falta de desaturación llevada a cabo por una ꞷ3 desaturasa de tipo FAD7, ya que una disminución de la temperatura de cultivo permitió la síntesis de linolenico por parte de la isoenzima de tipo FAD8. 6. El gen Hafdx aislado a partir de hojas de girasol codifica para ferredoxina fotosintética en distintos tejidos de girasol, como ha demostrado su patrón de expresión. La expresión heteróloga en E. coli nos ha permitido su purificación y posterior caracterización. 7. Usando cDNA de hojas de girasol se aisló clonó y secuenció el gen Hafad7 que codifica para una ꞷ3 desaturasa plastidial. 8. Las células de Synechocystis sp. PCC 6803 mutantes desB, carentes de linleato desaturasa inducible por baja temperatura, que expresaron heterologamente Hafad7 fueron capaces de sintetizar ácido α-linolénico independientemente de la temperatura de crecimiento. 9. La coexpresión de la proteína madura HaFAD7, portadora de un motivo dilisina en el extremo carboxilo, junto con la ferredoxina de girasol, su cofactor natural, permitió la correcta expresión de esta proteína en el retículo endoplásmico de Saccharomyces cerevisiae. El producto de la reacción se encontraba distribuido ente los fosfolípidos, triacilgliceroles y esteroles de la levadura. El análisis de la composición de ácidos grasos de los diferentes compartimentos, hizo patente el tráfico vesicular existente entre el retículo endoplásmico y las partículas lipídicas.