Structural and functional description of the mouse Tyr locus

Abstract

El juego completo de los elementos reguladores que son necesarios para lograr la expresio¿n correcta de los genes, lo cual incluye potenciadores, silenciadores y fronteras geno¿micas, puede estar distribuido a lo largo de muchos centenares de kilobases, muy alejados de la secuencia que codifica para la protei¿na. La descripcio¿n de este paisaje complejo requiere esfuerzos en la identificacio¿n de elementos clave, desde un punto de vista funcional y estructural, mediante el uso de ensayos de elementos indicadores en ce¿lulas en cultivo, e intentando reproducir la expresio¿n ge¿nica de intere¿s, artificialmente, en ratones transge¿nicos. En este trabajo describimos experimentos encaminados a descifrar la estructura y la funcio¿n del locus Tyr del genoma de rato¿n. Hemos focalizado nuestra atencio¿n en las fronteras geno¿micas, a partir de resultados previos del laboratorio. Mediante experimentos de Captura de Conformacio¿n Cromosomal (3C), la frontera Tyr 5¿ (tambie¿n conocida como LCR, de Regio¿n Controladora del Locus), ha sido caracterizada. A continuacio¿n, una segunda frontera geno¿mica, situada en la regio¿n 3¿ del locus, ha podido ser identificada, probada in vitro e in vivo, y, finalmente, mediante 3C, se ha constatado su contacto fi¿sico con el promotor del gen Tyr en todos los tipos celulares analizados. Sabemos que dos mecanismos diferentes (la presencia de CTCF y la transcripcio¿n a partir de los promotores RNA polimerasa II/III de los elementos SINEB2) confieren la propiedad aisladora a esta nueva frontera geno¿mica, la cual esta¿ igualmente involucrada en la estructura tridimensional del locus Tyr. Seguidamente, para probar la importancia, in vivo, de estas dos fronteras geno¿micas descritas en este trabajo, hemos generado diversas li¿neas de ratones transge¿nicos con mutaciones en cada una de estas secuencias, utilizando el nuevo sistema CRISPR/Cas9. Los individuos homocigotos que son portadores de la mutacio¿n en el elemento Tyr 5¿ muestran una reduccio¿n en la pigmentacio¿n del pelaje. Esta pigmentacio¿n no desaparece por completo, como ocurre en el caso de los ratones albinos, pero si¿ que se reduce de forma muy significativa. Estos resultados indican que el elemento Tyr 5¿ es relevante para la expresio¿n correcta del gen Tyr. Finalmente, las li¿neas de ratones transge¿nicos portadoras de mutaciones en el elemento Tyr 3¿ no mostraron alteracio¿n aparente en la pigmentacio¿n del pelaje, en fondo albino, lo cual sugiere que este segundo elemento regulador, conservado evolutivamente, no es indispensable para el control de la expresio¿n del gen Tyr, pero sin embargo podri¿a ser necesario para el control del gen vecino Nox4.