Estudio in vivo e in vitro de la estructura y función de la ribonucleasa P de cianobacterias

Resumen

En esta Tesis se han abordado cuatro objetivos parciales para profundizar en el conocimiento del mecanismo catalítico de la RNasa tanto in vivo como in vitro. Se ha clonado, purificado parcialmente y caracterizado la subunidad proteica de la RNasa P de la cianobacteria Pseudanabaena sp. PCC6903, demostrándose que tiene capacidad para reconstruir la actividad RNasa P con la subunidad RNA de diversas bacterias. Se ha clonado y caracterizado la subunidad proteica de la RNasa P de Thermus thermophilus, habiéndose detectado un solapamiento entre la secuenciaque codifica dicha proteína y la proteína ribosómica L34. El producto del gen rnpA de T.Thermophilus podría sufrir procesamiento proteolítico en su extremo amino para generar la proteína madura. Se ha realizado un estudio funcional detallado del lazo L15 de la subunidad RNA de la RNasa P de Pseudanabaena sp. PCC6903 y Synechocystis sp. PCC6803. La deleción de nucleótidos en este lazo no altera significativamente la estructura o la actividad del RNA catalítico. Este resultado indica que estos RNAs utilizan mecanismos alterantivos a lainteracción con el lazo L15 para unir el sustrato. La actividad in vivo de la Rnasa P se ha estudiado mediante un mutante con expresión condicional de la subunidad RNA desde un promotor regulado. La depleción de la RNasa P permite detectar la acumulación de precursores de los pre-tRNAs y otros RNAs que son sustratos de la RNasa P. El patrón de acumulación de precursores in vivo nos ha permitido estudiar el orden de procesamiento de un sustrato dimérico y determinar que el procesamiento en 3' puede ocurrir probablemente antes de que actúe la RNasa P.