Regulación de la producción del Exopolisacárido en Sinorhizobium fredii HH103, un simbionte de la soja y otras leguminosas

Resumen

Los rizobios son bacterias del suelo pertenecientes a las clases α- y β-Proteobacteria y que son capaces de llevar a cabo la fijación biológica del nitrógeno molecular en simbiosis con plantas leguminosas (Spaink et al., 1998; Suzaki et al., 2015) En esta relación, los rizobios inducen la formación de nuevos órganos llamados nódulos donde se diferencian a bacteroides, el estado capaz de fijar nitrógeno. Durante el proceso simbiótico tiene lugar un complejo diálogo molecular entre la planta y la bacteria, necesario para la infección de las raíces de la planta y la invasión de los nódulos formados por la planta. Los rizobios se encuadran en diferentes géneros de bacterias, siendo los más estudiados Rhizobium, Sinorhizobium (actualmente denominado Ensifer; Willems, 2006), Bradyrhizobium y Mesorhizobium, todos ellos pertenecientes a la clase α-Proteobacteria. Entre las leguminosas noduladas por los rizobios, se pueden encontrar varios e importantes plantas agrícolas como soja, judía y cowpea. La soja (Glycine max) es la leguminosa más importante agronómicamente a nivel mundial ya que se puede emplear para múltiples usos como alimento humano y animal, obtención de aceites vegetales a partir de sus semillas así como de productos “nutracéuticos” (beneficiosos para la salud) como isoflavonas, soponinas o fitoesteroles. La soja puede ser nodulada por estirpes de diferentes especies que pertenecen a los géneros Sinorhizobium, Mesorhizobium y Bradyrhizobium (Margaret et al., 2011; Rodríguez-Navarro et al., 2011), que a su vez pueden diferenciarse en función de su tasa de crecimiento (desde rizobios de crecimiento rápido a lento, respectivamente). S. fredii es una especie descubierta en China en 1985, y fue el primer rizobio de crecimiento rápido que incluía estirpes capaces de nodular soja. Las estirpes de S. fredii son capaces de nodular un alto número de leguminosas, pero muestran diferencias en su capacidad de nodular diferentes variedades de soja. De hecho, las tres estirpes más estudiadas hasta ahora difieren en esta característica: S. fredii NGR234 no es capaz de nodular soja, S. fredii USDA257 nódula variedades asiáticas de soja, pero es inefectivo con variedades americanas, y S. fredii HH103 es capaz de nódular ambos cultivares de soja, asiáticos y americanos. La simbiosis requiere un coordinado intercambio de señales entre la planta y el rizobio, y sólo cuando ambos simbiontes son compatibles, tiene lugar el proceso de nodulación (Downie, 2007; López-Baena et al., 2016). Este proceso comienza con la secreción, por parte de la planta, de un grupo de compuestos fenólicos llamados flavonoides que interaccionan con un regulador transcripcional bacteriano de tipo LysR, NodD. Sólo los flavonoides compatibles son capaces de activar este regulador. Por lo tanto, este paso establece una barrera de especificidad simbiótica para seleccionar sólo los simbiontes compatibles. Posteriormente, NodD activa la expresión de genes mediante su unión a secuencias específicas y conservadas de ADN localizas aguas arriba de estos genes y denominadas nod boxes (NB). Uno de los grupos de genes activados por NodD son aquellos (genes nod) responsables de la síntesis de los factores Nod (NF). Los NF son moléculas de lipo-quito-oligosacáridos compuestas de 2 a 6 residuos de N-acetil-glucosamina unida por enlaces β-1,4. El residuo de N-acetil-glucosamina localizado en el extremo no reductor se encuentra acilado por un ácido graso. Los NF pueden estar decorados con diferentes tipos de sustituciones (grupos fucosilos, metilos, sulfatos y acetilos) y ácidos grasos. Los NF se detectan por parte de la planta a través de los receptores de los NF (NFRs) localizados en las membranas de los pelos radicales. Este paso establece otra barrera simbiótica ya que el reconocimiento de los NF apropiados promueve la infección bacteriana y el inicio del desarrollo nodular. En caso positivo, el reconocimiento de los NF provoca una oscilación de la concentración de calcio dentro de los pelos radicales que, a través de una cascada de señalización, provoca diferentes respuestas, principalmente la curvatura del pelo radical (atrapando la población de rizobios) y formación de primordios nodulares. Posteriormente, la bacteria penetra dentro del pelo radical a través de unas estructuras tubulares llamados tubos de infección y eventualmente se liberan a células vegetales poliploides localizadas dentro de los nódulos. Dentro de estas células, las bacterias se diferencian en bacteroides y llevan a cabo la fijación de nitrógeno. Además de la infección a través de pelos radicales, existe otro método de infección llamado crack entry, donde la bacteria entra en las raíces a través de heridas en la superficie radical. Además de los NF, hay otras señales bacterianas que juegan papeles clave en la interacción simbiótica (Downie, 2010; López-Baena et al., 2016). Estas señales incluyen proteínas efectoras (llamadas Nops, nodulation outer protein), que se liberan al interior de las células hospedadoras a través del sistema de secreción de tipo III, y polisacáridos superficiales. En cuanto a los polisacáridos superficiales, los principales involucrados en simbiosis son los lipopolisacáridos (LPS) y los polisacáridos capsulares (KPS), los cuales se anclan a la membrana externa, los glucanos cíclicos (GC), localizados en el espacio periplásmico, y lo exopolisacáridos (EPS), que se liberan al medio extracelular o están débilmente unido a la superficie bacteriana. Se piensa que las Nops y los polisacáridos superficiales tienen papeles importantes en la interacción simbiótica como la disminución de la respuesta defensiva de la planta y/o actuando como señal simbiótica que se requiere a lo largo de las diferentes etapas del proceso de nodulación. Nuestro grupo de investigación ha trabajado en el estudio de la interacción simbiótica de S. fredii HH103 con diferentes plantas hospedadoras, incluyendo soja, desde hace más de 30 años (Margaret et al., 2011; López-Baena et al., 2016). Recientemente, hemos secuenciado el genoma de HH103 (Vinardell et al., 2015), compuesto por el cromosoma (4,3 Mb) y seis plásmidos, los cuales se nombran con una letra en función del tamaño del plásmido, pSfhh103a1 (~24 Kb), pSfhh103a2 (~25 Kb), pSfhh103b (~62 Kb), pSfhh103c (~144 Kb), pSfhh103d (~589 Kb) y pSfhh103e (~2,1 Mb). Durante los últimos 15 años, nuestro grupo ha estudiado los diferentes polisacáridos superficiales centrándose en sus estructuras, su relevancia simbiótica con diferentes plantas hospedadoras y la regulación de su producción. El principal objetivo de esta tesis era profundizar en la investigación de algunos aspectos específicos de los polisacáridos superficiales de S. fredii HH103. Específicamente, los objetivos concretos de esta tesis eran: 1. Caracterizar la región genética rkp-2 de S. fredii HH103 y estudiar su implicación en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. 2. Estudiar la relevancia de los diferentes polisacáridos superficiales de S. fredii HH103 en su interacción simbiótica con la leguminosa modelo Lotus. 3. Estudiar la regulación de la producción de EPS mediada por flavonoides en S. fredii HH103. 4. Caracterizar los genes mucR1 y mucR2 de S. fredii HH103 y estudiar su papel regulador sobre los genes involucrados en la producción de EPS. Objetivo 1. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Plant and Soil (Acosta-Jurado et al., 2017. Plant and Soil. Doi:10.1007/s11104-017-3268-z). En S. meliloti Rm41, los genes relacionados con la producción de KPS se distribuyen entre tres regiones genéticas (López-Baena et al., 2016), rkp-1, involucrada en la síntesis del lípido transportador del KPS, rkp-3, implicada en el transporte y síntesis de la subunidad de repetición del KPS, y rkp-2, compuesto por dos genes cuyos productos son responsables de la producción de ácido UDP-galacturónico desde el ácido UDP-glucurónico, catalizado por LpsL, y ácido UDP-glucurónico desde UDP-glucosa, catalizado por RkpK. Ambos genes se requieren para la producción de LPS, y rkpK también es necesario para la biosíntesis de KPS debido a la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. Estas tres regiones también están presentes en S. fredii HH103. En trabajos anteriores, nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo los estudios de las regiones rkp-2 y rkp-2 y ha demostrado su implicación en la producción de KPS, así como la de la región rkp-3 en la síntesis de LPS. En esta tesis, hemos investigado la implicación de la región rkp-2 en la producción de los polisacáridos superficiales de HH103. En este trabajo, hemos demostrado que los genes lpsL y rkpK de S. fredii HH103 no forman una unidad transcripcional y que la tasa de transcripción de rkpK es mucho mayor que la de lpsL. Los experimentos de PAGE mostraron que la inactivación de cada uno de estos genes dio lugar a alteraciones en el LPS, pero no afectó a la producción de KPS (confirmado por H-NMR), lo cual está en consonancia con la ausencia de ácidos urónicos en este polisacárido en S. fredii HH103. La mutación de rkpK también tuvo impacto sobre la producción del exopolisacárido (EPS), probablemente por la presencia de ácido glucurónico en este polisacárido. El aspecto sobre placas de YMA, cuantificación de los equivalentes de glucosa en medio YM y los experimentos de H-RMN confirmaron que la inactivación de rkpK no provoca una alteración del EPS sino una incapacidad para producir este polisacárido, sugiriendo que la disponibilidad de ácido glucurónico es esencial para la biosíntesis de EPS. El mutante rkpK mostró un incremento en la auto-agregación y osmosensibilidad y una reducción de la formación del biofilm sobre superficies plásticas. La inactivación de rkpK afectó negativamente a la simbiosis con cowpea (una reducción de alrededor del 50% del número de nódulos fijadores de nitrógeno) pero no con soja. La mutación de lpsL condujo a una deficiencia completa con cowpea, mientras que las plantas de soja inoculadas con este mutante sólo formaron pseudonódulos. En ambas plantas, el mutante lpsL mostró defectos en la infección de sus raíces. Los resultados presentados en este capítulo están son un buen ejemplo de como en dos bacterias íntimamente relacionadas (como S. meliloti y S. fredii) el mismo gen puede estar involucrado en la producción de diferentes polisacáridos superficiales, así que la inactivación de ese gen puede tener un impacto diferente en la capacidad simbiótica de estas bacterias con sus plantas hospedadoras. Además, nuestros resultados están en consonancia con trabajos anteriores de nuestro grupo demostrando la alta relevancia del LPS de HH103 en simbiosis con diferentes plantas hospedadoras. Objetivo 2. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016a. Mol Plant Microbe Interact. 29:925-937). En trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación se ha demostrado que S. fredii HH103 induce nódulos fijadores de nitrógeno en Lotus burttii pero nódulos inefectivos en L. japonicus Gifu (Sandal et al., 2012). En nuestro laboratorio tenemos disponible una colección de mutantes de HH103 afectados en la producción de diferentes polisacáridos superficiales. En esta tesis, hemos usado esta colección para investigar el posible papel (positivo o negativo) de cada uno de los polisacáridos superficiales de HH103 en su interacción con L. burttii y L. japonicus Gifu. Además, los estudios de microscopia confocal demostraron que S. fredii HH103 penetra en las raíces de L. burttii a través de roturas epidérmicas (de manera dependiente de factores Nod), a diferencia de Mesorhizobium loti MAFF303099 que infecta esta planta mediante tubos de infección (Maekawa et al., 2009). En cuanto a la interacción con L burttii, los mutantes de S. fredii HH103 incapaces de producir KPS y/o EPS no mostraron ningún tipo de defecto simbiótico, a diferencia de aquellos que tienen un perfil de LPS alterado, los cuales estuvieron afectados negativamente (se dieron reducciones severas del número de nódulos fijadores de nitrógeno). El mutante de S. fredii HH103 del gen cgs, incapaz de producir GC, mostró el mismo fenotipo simbiótico que con otras plantas hospedadoras (Crespo-Rivas et al., 2009); totalmente deficiente. Por otro lado, ninguno de los mutantes de S. fredii HH103 en polisacáridos superficiales ganó una nodulación efectiva con L. japonicus Gifu, sugiriendo que ninguno de estos polisacáridos es el responsable de la incompatibilidad simbiótica de S. fredii HH103 con esta planta. Objetivo 3. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en PLOS ONE (Acosta-Jurado et al., 2016b. PLOS ONE. 11:e0160499). A pesar del hecho que el EPS no muestra un papel importante en la simbiosis de S. fredii HH103 con diferentes leguminosas hospedadoras como soja, cowpea, Glycyrrhiza uralensis y Lotus burttii (Parada et al., 2006; Hidalgo et al., 2010; Margaret-Oliver et al., 2012; Acosta-Jurado et al., 2016a), la producción de este polisacárido está altamente regulado. Anteriores trabajos de nuestro grupo demostraron que la presencia de genisteína, un flavonoide inductor de los genes nod (Vinardell et al., 2004a), provocó una disminución de la mucosidad de HH103 en placas de YMA (Vinardell et al., 2004b). En esta tesis se demuestra que esta disminución de la mucosidad se debe a una reducción de la producción de exopolisacárido (confirmado por cuantificación de equivalentes de glucosa y análisis de H-RMN), y que este fenómeno no se da en otras estirpes de S. fredii como USDA257 o NGR234. Esta regulación negativa de la producción de EPS depende tanto de la capacidad del flavonoide para inducir la expresión de los genes nod como de la presencia de NodD1, indicando que, en S. fredii HH103, la biosíntesis de este polisacárido está conectada con el regulón nod. De hecho, en estudios anteriores hemos demostrado que NolR, un represor de los genes nod, tiene un efecto positivo sobre la producción de EPS en HH103. Teniendo en cuenta la importancia del EPS para los biofilm bacterianos, esta reducción de la producción de EPS por el tratamiento con flavonoides se correlaciona con la reducción de la capacidad formadora de biofilm. Mediante el uso de análisis de RT-PCR cuantitativa hemos demostrado que la expresión de los genes exoY1 y exoK se reprimió en cultivos de fase estacionaria de S. fredii HH103 en presencia de genisteína, siendo esta represión mayor en ausencia de NolR. Así, los resultados presentados en este trabajo demostraron que en la producción de EPS en S. fredii HH103 se regula de forma opuesta a otras señales bacterianas como los factores Nod y los efectores del sistema de secreción de tipo 3: Se reprime por flavonoides y NodD1 y se potencia por NolR. Estos resultados son acordes con nuestras observaciones anteriores en las que la ausencia de la producción de EPS en S. fredii HH103 no sólo no va en detrimento, sino que es beneficiosa para la simbiosis con soja. Además, nuestros resultados mostraron como bacterias íntimamente relacionadas pueden diferir en la regulación de sus polisacáridos superficiales: en S. fredii NGR234 la presencia de flavonoides disminuye la cantidad de KPS producido y promueve la biosíntesis de un tipo nuevo de LPS mientras que en HH103 afecta negativamente a la producción de EPS. Objetivo 4. Los resultados presentados en el correspondiente capítulo han sido publicados en Molecular Plant-Microbe Interactions (Acosta-Jurado et al., 2016c. Mol Plant Microbe Interact. 29:700-712). En los rizobios, el control de la producción de EPS es muy complejo y conlleva la participación de numerosas proteínas reguladoras, segundos mensajeros como di-GMP-c y sistemas de quorum sensing. Dentro de los reguladores, la proteína de tipo zinc finger MucR potencia la producción de EPS en los rizobios, como Sinorhizobium meliloti y Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, y participa en diversos procesos en otras bacterias como Caulobacter, Pseudomonas o Brucella (Janczarek, 2011; Mirabella et al., 2013; Caswell et al., 2013; Wang et al., 2015). MucR regula la expresión génica mediante su unión a secuencias palindrómicas llamadas mucR boxes. Estudios recientes han demostrado que esta proteína puede considerarse como un regulador global ya que está involucrado en el control de la expresión de genes de movilidad, quimiotaxis, virulencia e incluso NF, dependiendo de la bacteria. La secuenciación reciente del genoma de S. fredii HH103 ha revelado la presencia de dos copias de mucR en esta estirpe, mucR1 y mucR2. En esta tesis, hemos estudiado estos genes, centrándonos en su relevancia en la producción de EPS y en la simbiosis con soja y L. burttii. Como ha sido recientemente descrito en mucR2 de CCBAU45436 (Jiao et al., 2016), probablemente MucR2 de S. fredii HH103 no sea funcional debido a un cambio de pauta de lectura en su gen codificante. De hecho, el mutante mucR2 de S. fredii HH103 no mostró ninguna diferencia con la estirpe silvestre en ninguna de las características analizadas en este trabajo. Por el contrario, la inactivación de mucR1 provoca una reducción drástica de la producción de EPS, confirmado por aspecto de la mucosidad en placas de YMA, experimentos de H-NMR y cuantificación de los equivalentes de glucosa. Inesperadamente, el mutante ΔmucR1 mostró un incremento notable en su capacidad formadora de biofilm, probablemente debido al incremento de la agregación en la interfase aire-líquido. Además, la producción de GC extracelulares se incrementó en este mutante, probablemente como consecuencia de la reducción en la producción de EPS. Este mutante también mostró una reducción drástica de la capacidad fijadora de nitrógeno con G. max y L. burttii. Sin embargo, en estas dos leguminosas, el número de nódulos inducidos por el mutante mucR1 se incrementó y redujo respectivamente en comparación con la estirpe parental, indicando que MucR1 pueda afectar de forma diferente a la nodulación dependiendo de la planta hospedadora. Los análisis de RNA-Seq llevados a cabo en presencia y ausencia de flavonoides demostraron que MucR1 controla la expresión de cientos de genes (incluyendo algunos relacionados con la movilidad, producción de EPS o transporte de GC), algunos de ellos relacionados con el regulón nod. Estos estudios confirmaron trabajos anteriores indicando que en los rizobios MucR es un regulador global que controla numerosos procesos que pueden ser importantes en la transición de vida libre al estado simbiótico.