Identification and characterization of microRNAs in porcine circovirus type 2 and African swine fever virus infections in vivo

Resumen

Cuatro estudios diferentes fueron llevados a cabo con el fin de analizar la expresión de microRNAs (miRNAs) porcinos y virales en dos infecciones in vivo diferentes con circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y el virus de la peste porcina africana (VPPA). El objetivo del primer estudio fue identificar el patrón de expresión de miRNAs en cerdos infectados y no infectados con PCV2. Para ello, se llevó a cabo una infección experimental y se construyeron librerías de ARN de pequeño tamaño de tonsila y linfonodo mediastínico de estos animales. La secuenciación masiva determinó diferencias de expresión de miRNAs porcinos entre animales infectados y no infectados. La predicción del análisis funcional mostró que estos miRNAs pueden estar involucrados en rutas biológicas relacionadas con el sistema inmune y en procesos relacionados con la patogénesis provocada por PCV2. El objetivo del segundo estudio fue investigar si PCV2 puede codificar miRNAs virales. A partir de las librerías ya construidas, los resultados de la secuenciación masiva revelaron que PCV2 no expresa miRNAs en una infección subclínica in vivo. En el tercer estudio se analizó la diferencia de expresión de miRNAs en bazo y linfonodo submandibular en infecciones in vivo con el VPPA entre i) animales infectados con la cepa virulenta E75 de VPPA a distintos tiempos (3 y 7 días postinfección) y ii) entre animales infectados con la cepa virulenta E75 y animales infectados con la cepa derivada de ésta y atenuada E75CV1 a un mismo tiempo post- infección (3 días post- infección). Se crearon librerías de ARN de pequeño tamaño y la secuenciación masiva de las mismas mostró diferencias de expresión de miRNAs en ambos casos. Además, se observó la asociación de los miRNAs diferencialmente expresados con genes porcinos y virales involucrados en la respuesta inmune y las interacciones virus- hospedador. En el cuarto estudio se analizó la posibilidad de que VPPA codificase miRNAs virales. Para ello se emplearon las muestras previas de E75 y E75CV1 y se añadieron al estudio muestras de animales infectados con la cepa atenuada E75CV1 y sacrificados a día 31 post- infección aparte de animales infectados con esta misma cepa y re-inoculados a día 31 post- infección con la cepa virulenta Ba71 y eutanasiados a día 38 post- infección. La secuenciación masiva de todas las librerías de ARN de pequeño tamaño mostró que VPPA no expresa miRNAs virales en ninguna de las condiciones estudiadas. Four studies were carried out in order to explore the expression of porcine and viral microRNAs (miRNAs) in two different in vivo infections with porcine circovirus type 2 (PCV2) and African swine fever virus (ASFV). The objective of the first study was to analyze the porcine miRNAs expression pattern in subclinically infected and non- infected pigs with PCV2. For this end, an experimental infection was carried out and small RNA libraries were constructed from tonsil al mediastinal lymph node from infected and non- infected animals. Highthroughput sequencing determined differences in the expression of porcine miRNAs between infected and noninfected animals. The prediction analysis showed that these differentially expressed miRNAs could be involved in biological pathways related to immune system and processes related to PCV2 pathogenesis. The objective in the second study was to explore if PCV2 encodes viral miRNAs. From the previously constructed libraries, highthroughput sequencing revealed that PCV2 does not encode viral miRNAs in an in vivo subclinical infection. In the third study the expression pattern of porcine miRNAs in spleen and submandibular lymph node in ASFV in vivo infections was assessed between: i) animals infected with E75 ASFV virulent strain at different times (3 and 7 days post- infection) and ii) between animals infected with E75 virulent strain and E75CV1 attenuated strain at the same time point postinfection (3 days post- infection). Small RNA libraries were constructed and the highthroughput sequencing revealed miRNAs differentially expressed in both cases. In addition, it was observed that these miRNAs were associated to porcine and viral genes involved in immune response and host- pathogen interactions. In the fourth study, it was analyzed the capability of ASFV to encode viral miRNAs. For this end, previous samples from the infections with E75 and E75CV1 were used in addition to samples from animals infected with the attenuated strain and sacrificed at day 31 postinfection and also, animals infected with this attenuated strain, re- inoculated at day 31 with the virulent strain Ba71 and euthanized at day 38 post- infection. Highthroughput sequencing from all the small RNA libraries revealed that ASFV does not encode viral miRNAs in any of the studied conditions.