Caracterización de las rutas de MAP Quinasas de respuesta a estrés e integridad celular, y su interacción funcional con otras vías de señalización intracelular en Schizosaccharomyces pombe

Resumen

Las proteínas quinasas C (PKCs) juegan un papel esencial durante la regulación de numerosos procesos fisiológicos en los organismos eucariotas. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe posee dos ortólogos a PKC, Pck1 y Pck2, que actúan aguas arriba del módulo de MAP quinasas de integridad celular regulando la morfogénesis y la biosíntesis de la pared celular. Los resultados revelaron que, pese a su fuerte similitud estructural y redundancia funcional, los mecanismos que regulan la maduración, activación y estabilización de ambas quinasas tienen un impacto biológico notablemente distinto. Así, la fosforilación in vivo de Pck1 en el bucle de activación y en los motivos de giro e hidrofóbico es esencial para su estabilidad y funciones biológicas. Por el contrario, Pck2 es parcialmente funcional independientemente de su actividad catalítica. Sorprendentemente, la activación constitutiva promueve la desfosforilación y la desestabilización de Pck2, mientras que aumenta los niveles de Pck1, lo que provoca un fenómeno de interferencia de la señalización aguas abajo hacia la ruta de integridad celular dependiente de Pck2. Estos resultados indican que la evolución temprana a partir de un antepasado común implicó cambios importantes en los mecanismos que regulan la activación catalítica y la estabilidad de los miembros de la familia PKC, lo que permitiría un control flexible de sus funciones biológicas, incluyendo señalización por rutas de MAP quinasas. Las rutas TOR desempeñan un papel clave en el control del crecimiento y envejecimiento celular, y su disfunción provoca enfermedades como el cáncer, obesidad y diabetes. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinar que combina técnicas genéticas, bioquímicas, y de biología celular, con el fin de estudiar las interacciones funcionales de las rutas de integridad celular (CIP) y TOR durante el control del crecimiento y la respuesta celular frente al estrés. Nuestros resultados sugieren que Rhy1, la GTPasa activadora del complejo TORC2 en S. pombe, activa la ruta CIP mediante dos mecanismos distintos. El primero incluye a los complejos TORC2-Gad8 y TORC1-Psk1, que promueven la síntesis de Pck2 en respuesta al estrés inducido por daño en la pared celular o tras el ayuno de glucosa. En el segundo mecanismo Ryh1 activa a la MAPK Pmk1 de forma independiente de TORC2, regulando la localización y/o tráfico en la membrana plasmática de activadores de la ruta como la PDK Ksg1 y el GEF Rgf1. Por último, Pmk1 actúa aguas arriba de Ryh1 para inhibir la señalización de TORC2 en respuesta a estrés. La coordinación de las rutas TOR y de MAP quinasas de integridad celular por medio de activaciones e inhibiciones cruzadas permitirían modular de manera precisa la adaptación y supervivencia celulares frente a múltiples situaciones ambientales. A diferencia del resto de proteínas quinasas, la activación catalítica de las MAP implica la fosforilación dual en dos residuos de tirosina y treonina del motivo conservado -TXY-. Se ha empleado S. pombe como modelo para analizar la posible relevancia biológica de las formas monofosforilables de MAP quinasas Pmk1 y Sty1 (ruta de respuesta a estrés). Nuestros resultados sugieren que ambas quinasas se fosforilan mediante un mecanismo secuencial de tipo "procesivo" en el que la fosforilación en tirosina es un pre-requisito para la fosforilación en el residuo de treonina tanto en condiciones basales como en respuesta a estrés. De hecho, la imposibilidad de fosforilación de Sty1 y Pmk1 en el residuo de treonina del bucle de activación provoca la unión constitutiva entre MAPKK y MAPK, con la consiguiente hiperfosforilación en el residuo de tirosina. Las formas monofosforiladas en treonina de las MAP quinasas Sty1 y Pmk1 son funcionales in vivo, aunque de forma parcial, siendo capaces de promover una respuesta adaptativa moderada frente a estrés.