Papel de Ksg 1 y el ortólogo de PKC Pck2 sobre la regulación de la ruta de integridad celular en Schizosaccharomyces pombe

Resum

Las proteínas quinasas C (PKC) constituyen un numeroso grupo de enzimas implicadas en rutas de transducción de señales en células eucariotas, y que en organismos superiores participan en multitud de funciones fisiológicas. Su activación es dependiente de fosforilación en una serie de motivos conservados del dominio de activación situado en su extremo carboxilo terminal y que se conocen como bucle de activación, motivo de giro y motivo hidrofóbico. La quinasa dependiente de fosfoinosítidos PDK-1 es la responsable de la fosforilación in vivo del bucle de activación de la mayoría de las PKCs, mientras que la fosforilación del motivo de giro e hidrofóbico puede tener lugar mediante autofosforilación o es realizada por la quinasa del complejo mTOR. Sin embargo, en algunos casos la activación catalítica no depende de fosforilación en los motivos citados, revelando la existencia de mecanismos alternativos que regulan la fosforilación y activación de estas enzimas. La levadura Schizosaccharomyces pombe se encuentra más próxima filogenéticamente a las células eucariotas superiores que el resto de las levaduras. Existe una elevada homología funcional en las vías de señalización intracelular entre S. pombe y eucariotas superiores, lo que la convierte en un modelo excelente para investigar distintas respuestas celulares con significación general. S. pombe posee dos ortólogos de PKC (Pck1 y Pck2) que regulan de forma coordinada la biosíntesis de ? y ?-glucano de la pared celular, y comparten funciones esenciales durante el crecimiento vegetativo, ya que la doble deleción de ambos genes es letal. Las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas se encuentran altamente conservadas a lo largo de la evolución y son esenciales durante la respuesta defensiva y/o adaptativa de las células eucariotas frente a distintos estímulos ambientales y situaciones de estrés. En S. pombe la ruta de integridad celular, cuyo elemento central es la MAP quinasa Pmk1, es fundamental para la regulación de la construcción de la pared celular, la citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas, y la homeostasis iónica. Aunque Pck2 y la GTPasa Rho2 son los responsables fundamentales de la activación de Pmk1 en respuesta a estrés, la ruta se encuentra ramificada, y recientemente nuestro grupo ha demostrado que la GTPasa esencial Rho1 y Pck1 pueden activar la ruta en situaciones específicas como en respuesta al daño en la pared celular. Ksg1, el ortólogo a PDK1 en la levadura con fisión, es una quinasa esencial que fosforila el bucle de activación de varias quinasas de la familia AGC. Mutantes que expresan alelos hipomórficos de Ksg1 muestran graves defectos morfológicos; sin embargo se desconoce su posible papel durante la activación catalítica de Pck2 y Pck1, y su significación biológica. Al contrario que otros organismos modelo, los mutantes simples pck1 ? o pck2? son viables, por lo que S. pombe y la ruta de integridad celular constituyen un sistema biológico ideal para estudiar con precisión los mecanismos regulatorios responsables de su activación. En esta Tesis Doctoral nos hemos centrado en el análisis exhaustivo de Pck2, dado que su papel como activador de la ruta de integridad celular es más relevante que el de Pck1. Por medio de la construcción y el análisis de versiones mutantes de las distintas proteínas descritas previamente, las principales conclusiones alcanzadas en la presente Tesis Doctoral: 1- Ksg1, es necesario para la correcta activación de Pmk1 durante el crecimiento vegetativo y en respuesta a múltiples situaciones de estrés. 2- Ksg1 se asocia in vivo con Pck1 y Pck2. Ksg1 fosforila in vivo a Pck2 en el residuo conservado de treonina-842 presente en su bucle de activación. La fosforilación del bucle de activación de Pck2 también se encuentra regulada por un mecanismo de autofosforilación. 3- La autofosforilación es probablemente el mecanismo responsable de la fosforilación in vivo del residuo conservado de treonina-984 del motivo de giro de Pck2. 4- A diferencia de la mayoría de PKCs, la fosforilación in vivo de Pck2 en el sitio conservado del bucle de activación (treonina-842) no es necesaria para la transmisión de señales hacia la ruta de MAP quinasas integridad celular durante el crecimiento y en respuesta a estrés. 5- La activación catalítica y función biológica de Pck2 es dependiente de la fosforilación conjunta de los residuos de treonina-842 (bucle de activación) y -984 (motivo de giro) del dominio de activación. Evidencias adicionales sugieren que este proceso es también regulado por fosforilación del residuo conservado de treonina en posición 846 dentro del bucle de activación. 6- La síntesis de novo de Pck2 y la fosforilación en treonina-842 del bucle de activación se incrementan notablemente en respuesta a estreses térmico y salino, durante el daño en la pared celular, o tras el ayuno de glucosa. 7- La síntesis de novo de Pck2 es crítica para la activación de Pmk1en respuesta al daño en la pared celular o tras el ayuno de glucosa, pero no en respuesta al estrés osmótico salino. 8- El complejo TORC2 no fosforila in vivo a Pck2, pero favorece su síntesis de novo durante el crecimiento vegetativo y en respuesta a estrés, permitiendo la activación de Pmk1 en respuesta al daño en la pared celular o al ayuno de glucosa. In eukaryotic organisms the protein kinase C (PKC) family is a group of serine/threonine kinases belonging to the AGC class which play essential roles in signaling pathways controlling cell growth, morphogenesis, differentiation, and cell death. PKC isoforms share a basic structure consisting in a variable N-terminal regulatory domain followed by a highly conserved C-terminal kinase domain. The core of the kinase domain contains three conserved phosphorylaton sites critical for catalytic activity known as the activation loop (AL), the turn motif (TM), and the hydrophobic motif (HM). The 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1), an AGC kinase family member itself, is the activation loop kinase of most PKCs and other AGC kinases like PKC-related protein kinases, or protein kinase A. AL phosphorylation of PKCs is crucial for their activation with the sole exception of PKC? . Interestingly, mammalian PKC isoforms like PKC? or PKC? become phosphorylated at the AL through PDK-1 independent mechanisms involving autophosphorylation or unknown kinase/s . Mammalian target of rapamycin (mTOR) or an autophosphorylation mechanism phosphorylates the turn and hydrophobic motifs in mammalian PKCs. However, the catalytic activity requirement for the phosphorylation in both motifs varies strongly among the family members, suggesting that alternative mechanisms regulate their activation and downstream signaling functions. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has two PKC orthologs named Pck1 and Pck2. The pck1? or pck2 ? single mutants are viable but simultaneous deletion is lethal. The N-terminus of both kinases contains two HR1 Rho binding repeats resembling those present in mammalian PRK1 and PRK2 which bind active GTPases Rho1 or Rho2. Pck1 and Pck2 are unstable, and interaction with GTP-Rho1 or GTP-Rho2 through N-terminal PEST sequences increases their stability. Rho1-mediated stabilization promotes increased phosphorylation of Pck2 at T842 within the AL. GTP-bound Rho2 might also stabilize Pck2, since most Rho2 effects are mediated by Pck2, and Pck2 is stabilized in cells lacking the Rho2-GAP Rga2. Rho1 and Rho2 coordinately regulate through Pck2 the biosynthesis of (1,3) ?-D-glucan (Rho1) and ?-glucan (Rho2), the two main cell wall polymers in fission yeast. In addition, Rho1, Rho2, and Pck2 are key upstream activators of the cell integrity MAPK pathway (CIP), whose central element, Pmk1, becomes activated 78 under adverse conditions and regulates cell separation, morphogenesis, cell wall construction, or ionic homeostasis. Rho1 and Rho2 support Pmk1 activity during vegetative growth primarily through Pck2. However, whereas the Rho2-Pck2 branch is fully responsible for MAPK activation in response to hyper- and hypo-osmotic stress, both Rho1 and Rho2 target Pck2 for signaling cell wall damage to the CIP. In addition, Pmk1 activation under osmostress is quick and transient, whereas MAPK activation induced by cell wall stress or glucose deprivation is delayed and progressive, suggesting the existence of specific factors determining the kinetics and magnitude of the response. PDK-1 ortholog Ksg1, which is essential for vegetative growth in fission yeast, phosphorylates the AL of AGC kinases like Gad8, Pka1, and Psk1. T842 within Pck2 AL is indeed phosphorylated in vivo, but the identity of Ksg1 as the upstream activating kinase remains unexplored. Strains expressing conditional ksg1 thermosensitive alleles show marked morphology defects and sensitivity to staurosporine, a potent PKC inhibitor, suggesting that in fission yeast Ksg1 might control the CIP via Pck2. In this work we conducted a comprehensive study to investigate how Pck2 activity is regulated in vivo in fission yeast during growth and in response to stress, by using the CIP as a biological reporter. Our results show that in vivo phosphorylation of Pck2 at the conserved T842 activation loop during growth and in response to different stresses is mediated by the PDK ortholog Ksg1 and an autophosphorylation mechanism. However, T842 phosphorylation is not essential for Pmk1 activation, and putative phosphorylation at T846 might play an additional role for Pck2 catalytic activation and downstream signaling. These events together with turn motif autophosphorylation at T984 and binding to small GTPases Rho1 and/or Rho2 stabilize and render Pck2 competent to exert its biological functions. Remarkably, the TORC2 complex does not participate in catalytic activation of Pck2, but instead contributes to de novo Pck2 synthesis which is essential to activate the CIP in response to cell wall damage or glucose exhaustion. These results unveil a novel mechanism whereby TOR regulates PKC function at a translational level and add a new regulatory layer to MAPK signaling cascades.