Función citoplásmica de la proteína supresora de tumores HSNF5

Resumen

Como componente del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF, hSNF5 ha sido considerada una proteína de localización nuclear, cuya mutación da lugar al desarrollo de tumores rabdoides. Sin embargo, su localización citoplásmica transitoria tras infección por HIV-1 y la existencia de una secuencia de exporte nuclear en su secuencia llevó a plantearnos la posible existencia de una fracción citoplásmica en condiciones normales de crecimiento celular. Para abordar este primer objetivo se llevaron a cabo fraccionamientos bioquímicos e inmunofluorescencias en diferentes líneas celulares, así como experimentos in vivo de pérdida de fluorescencia en el fotoblanqueado (FLIP). Los resultados obtenidos demostraron la existencia de una fracción citoplásmica de hSNF5 en células cultivadas en condiciones normales de crecimiento que presenta un continuo intercambio dinámico entre el núcleo y el citoplasma. El segundo objetivo consistió en identificar proteínas que interaccionen con hSNF5 en el citoplasma, hecho que ayudaría a esclarecer su función en este compartimento celular. Mediante ensayos de doble híbrido y análisis por espectrometría de masas identificamos las interacciones entre hSNF5 y las proteínas de localización citoplásmica Cog2, Eif2b, Scmh1, CAD, MMS19, SLC25A5, RPS3, CNX, GRP78 y Dinamina. Las interacciones entre hSNF5 y CAD, CNX y Dinamina2 fueron verificadas mediante más de una aproximación experimental. En esta tesis se ha investigado principalmente la interacción existente entre hSNF5 y Dinamina2, una GTPasa implicada en multitud de eventos celulares entre los que destaca la endocitosis. Esta interacción ha sido verificada mediante ensayos in vivo, llevados a cabo en levaduras (doble híbrido) y en líneas celulares en cultivo (coinmunoprecipitacion, colocalización, PLA), e in vitro (pull down). Los resultados obtenidos demuestran que la interacción existente entre hSNF5 y Dinamina2 es directa, ocurre en presencia de GTP y GDP, y tiene lugar en el citoplasma. Además, hSNF5 afecta in vitro negativamente a la actividad de la Dinamina2 ensamblada sin afectar a su ensamblaje. El silenciamiento de hSNF5 pero no el de otros componentes del complejo SWI/SNF, como BRG1 o hBRM, desestabiliza Dinamina2 y afecta negativamente a procesos endocíticos dependientes de esta proteína, como son la endocitosis mediada por clatrina y la endocitosis de fase fluida. En conclusión, la identificación de la interacción existente entre hSNF5 y Dinamina2 en el citoplasma ha permitido revelar la única función conocida de este supresor tumoral en este compartimento celular como modulador de la endocitosis. Su ausencia afecta negativamente a procesos endocíticos dependientes de Dinamina2, desestabilizándola y afectando a su actividad GTPasa. Además, el análisis de expresión génica en células humanas silenciadas para hSNF5 o Dinamina2 indica que una parte importante del fenotipo de transcripcional en ausencia de hSNF5 puede deberse a la deficiente endocitosis más que a efectos transcripcionales directos provocados por la carencia de esta proteína en el núcleo. Todo ello abre nuevas perspectivas en comprender el papel de hSNF5 en tumorigénesis. BIBLIOGRAFIA 1Hargreaves DC, Crabtree GR. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Res 2011; 21: 396-420. 2 Versteege I, Sevenet N, Lange J, Rousseau-Merck MF, Ambros P, Handgretinger R et al. Truncating mutations of hSNF5/INI1 in aggressive paediatric cancer. Nature 1998; 394: 203-206. 3 Roberts CW, Biegel JA. The role of SMARCB1/INI1 in development of rhabdoid tumor. Cancer Biol Ther 2009; 8: 412-416. 4 Wilson BG, Roberts CW. SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer. 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