Optimizing crispr-cas technologies in caenorhabditis elegansnested crispr and expanded targeting with cas variants

Resumen

In this thesis, I present an alternative, cloning-free method for the generation of endogenous fluorescent reporters in the nematode Caenorhabditis elegans. I demonstrate that Nested CRISPR is an efficient method that can be customized for the insertion of a suite of fluorescent tags and epitopes at endogenous loci using a combination of single-stranded and double-stranded DNA repair templates. In this thesis, I also demonstrate the use of enzymes other than Cas9 to target non-NGG PAM sites. The results show that AsCas12a can perform efficient genome editing in TTTV PAMs. Furthermore, the structurally engineered Cas9 variants SpG and SpRY can mediate genome editing in NGN and NYN PAMs, respectively, via both error-prone and precise repair mechanisms under optimized conditions. En esta tesis presento un método alternativo, sin la necesidad de clonaciones moleculares, para la generación de reporteros endógenos fluorescentes en el nematodo Caenorhabditis elegans. Demuestro que Nested CRISPR es una técnica eficiente que puede ser adaptada para la inserción de diversos etiquetas y epítopos fluorescentes en loci endógenos empleando una combinación de moldes de reparación de ADN de cadena simple y doble. También demuestro el uso de enzimas distintas a Cas9 para cubrir secuencias PAM distintas de NGG. Los resultados muestran que AsCas12a puede realizar la edición genómica de manera eficiente en PAMs TTTV. Además, las variantes estructuralmente diseñadas de Cas9, SpG y SpRY, pueden llevar a cabo edición genómica en PAMs NGN y NYN respectivamente, mediante mecanismos propensos a errores y de reparación precisa, en condiciones optimizadas. List of Publications: 1. Vicencio, J., & Cerón, J. (2021). A Living Organism in your CRISPR Toolbox: Caenorhabditis elegans Is a Rapid and Efficient Model for Developing CRISPR-Cas Technologies. CRISPR Journal, 4(1), 32–42. https://doi.org/10.1089/crispr.2020.0103 2. Vicencio, J., Martínez-Fernández, C., Serrat, X., & Cerón, J. (2019). Efficient Generation of Endogenous Fluorescent Reporters by Nested CRISPR in Caenorhabditis elegans. Genetics, 211(April), 1143–1154. https://doi.org/10.1534/genetics.119.301965 3. Vicencio, J., Sánchez-Bolaños, C., Moreno-Sánchez, I., Brena, D., Kukhtar, D., Ruiz-López, M., Cots-Ponjoan, M., Vejnar, C. E., Rubio, A., Rodrigo Melero, N., Carolis, C., Pérez-Pulido, A. J., Giráldez, A. J., Kleinstiver, B. P., Cerón, J., & Moreno-Mateos, M. A. (2021). Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2021.06.06.447255