Papel de la melatonina en los procesos inflamatorios mediados por mastocitosImplicaciones clínicas

Resumen

Los mastocitos son una población de células heterogéneas, localizadas en los tejidos conectivos del organismo, que desarrollan respuestas alérgicas y antiparasitarias mediadas por la IgE y otros receptores. Estas células generan reacciones urgentes donde la inflamación es, en sí, un mecanismo protector frente a la amenaza detectada, cuyo objetivo es restaurar la homeostasis en el tejido dañado eliminando o aislando el agente causante que la puso en marcha. Para ello, y tras apenas unos treinta minutos desde que se detectó el estímulo comienza su etapa aguda, durante la cual los mastocitos vierten al tejido las moléculas preformadas y almacenadas en sus gránulos, produciéndose en consecuencia cambios morfológicos y fisiológicos característicos de los procesos inflamatorios. Todo ello, se traduce en la aparición de sus signos característicos calor, rubor, dolor y tumor. Posteriormente, y si sigue actuando el instigador, se desarrolla la fase tardía (dos horas tras el estímulo) donde se sintetizan y liberan leucotrienos y prostaglandinas, así como citoquinas entre las que se encuentran: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-8, IL-10, IL-13. Dicho mecanismo es de gran importancia para el organismo, y es por ello que los tejidos, para asegurar su activación, establecen estrategias redundantes. Sin embargo, cuando la amenaza es eliminada resolver los diferentes frentes establecidos que activaron la inflamación puede convertirse en una empresa complicada. Es por ello, que la investigación en este campo se enfoca, al menos en parte, en la búsqueda o desarrollo de fármacos que permitan su resolución con éxito evitando su cronificación. Siguiendo esta línea, uno de los fármacos estudiados es la melatonina, la cual es una indolamina que presenta gran variedad de propiedades. Así, cabe destacar que durante el proceso inflamatorio desarrolla un papel dual por el cual funciona como una citoquina pro-inflamatoria más, y posteriormente, cuando ya no es necesario ayuda a la restitución de la homeostasis gracias a sus muchas capacidades como son la antioxidante, citoprotectora, inmunomoduladora y anti-inflamatoria. Concretamente, a través de ellas consigue reducir los radicales libres procedentes del metabolismo del oxígeno y del nitrógeno, mejorar la viabilidad celular, estimular o reducir la respuesta inmune e inhibir la activación del factor NF-κβ. OBJETIVOS: En nuestro estudio se establecieron dos objetivos principales: analizar el efecto del tratamiento exógeno de la melatonina, una molécula inmunomoduladora, sobre la línea de mastocitos RBL-2H3, modelo de inflamación in vitro, e identificar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estos efectos y, también, trasladar nuestros descubrimientos básicos a la clínica. HÍPOTESIS: En función de nuestros objetivos establecimos las hipótesis en las que trabajamos. A través de ellas, queríamos conocer si la administración exógena de la melatonina: - Mejora la viabilidad celular y la regeneración del mastocito tras el estímulo químico. - Si inhibe la activación del mastocito reduciendo la síntesis y liberación de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6). - Si interviene en la síntesis y liberación de la melatonina endógena por parte del mastocito. MATERIAL Y MÉTODOS: Se usaron cultivos de mastocitos RBL-2H3 que crecieron en medio con suero fetal bovino descomplementado, CO2 al 5% y 37ºC, los cuales fueron sometidos a diferentes tiempos de estimulación química mediante forbol-12-miristato-13-acetato más calcio ionóforo (PMACI) para conocer su inducción de citotoxicidad o su efecto sobre la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias. Posteriormente, se realizaron pre-tratamientos con melatonina (durante 30 minutos) a concentraciones fisiológicas y farmacológicas para estudiar su capacidad citoprotectora y su efecto sobre la liberación de citoquinas y los niveles de melatonina endógena. Por otro lado, se estudió el efecto del antagonista selectivo luzindol sobre sus capacidades citoprotectoras. A su vez, estudiamos el efecto de la melatonina sobre la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias y la propia melatonina endógena y sobre los mecanismos intracelulares responsables de la citoprotección. Para ello, se usó el ensayo MTT para estudiar la viabilidad celular, así como la técnica de enzimoinmunoanálisis (ELISA) para la medición de citoquinas en el sobrenadante del medio de cultivo. Para el estudio de la expresión proteica de la miosina IIa e IKKα/β se usó la técnica de western blotting, un sistema de transferencia semiseca y un sistema de detección de proteínas mediante quimioluminiscencia. RESULTADOS: El ensayo de MTT nos permitió determinar que la citotoxicidad generada sobre los cultivos mastocitarios con el estímulo químico (PMACI) era tanto dosis como tiempo dependiente. Así, y de manera estadísticamente significativa, a mayor tiempo de exposición al PMACI, mayores eran los daños celulares detectados; los cuales fueron extremos ante periodos iguales o mayores a 14 horas. Detectamos, también, que dicha estimulación con PMACI produce un aumento en la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-6, así como de la melatonina endógena, los cuales disminuyeron si fueron precedidos del pre-tratamiento con melatonina. Se observó que el pretratamiento con melatonina (30 minutos) mejoró la viabilidad celular de modo estadísticamente significativo, siendo mayor su capacidad a concentraciones farmacológicas; mientras que las concentraciones fisiológicas muestran esta capacidad citoprotectora tras 12 horas de experimentación. Aunque cabe destacar que en presencia del antagonista selectivo para los receptores MT1 y MT2 llamado luzindol, su capacidad citoprotectora disminuye, aunque no del todo. Por último, se detectó que el pretratamiento con melatonina disminuye la activación del complejo IKKα/β lo que le permite desarrollar su papel anti-inflamatorio. CONCLUSIONES: La estimulación química mediante PMACI activa a los mastocitos de manera tiempo y dosis dependiente. El pretratamiento con melatonina, sobre todo a concentraciones farmacológicas, ejerce protección celular cuando los mastocitos fueron estimulados con PMACI. La estimulación química mediante PMACI introduce al mastocito en un estado de hiperestimulación con un aumento de los niveles de TNF-α, IL-6 y de melatonina endógena; cuando se realizó el pretratamiento con melatonina disminuyó la síntesis y liberación de las mismas. Esta capacidad se revierte en presencia de luzindol. La melatonina exógena en ausencia de estimulación química no afecta los niveles de TNF-α, IL-6 o de melatonina endógena (MELn). El pretratamiento con melatonina, tanto a concentraciones fisiológicas como farmacológicas, en mastocitos estimulados, inhibe la activación de la ruta de activación mastocitaria IKK/NF-κβ de forma estadísticamente significativa.