Autofagia en el estrés e interacciones con la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC): efecto de las modificaciones postraduccionales de la proteína sobre su estabilidad y su reclutamiento a la vía autofágica

  1. Baena Vaca, Guillermo
Zuzendaria:
  1. Sofía García Mauriño Ruiz Berdejo Zuzendaria
  2. José Antonio Monreal Hermoso Zuzendaria

Defentsa unibertsitatea: Universidad de Sevilla

Fecha de defensa: 2019(e)ko apirila-(a)k 26

Epaimahaia:
  1. Cristina Echevarría Ruiz de Vargas Presidentea
  2. María Teresa Navarro Gochicoa Idazkaria
  3. Luisa María Sandalio González Kidea
  4. Carlos García-Mata Kidea
  5. Cecilia Gotor Martínez Kidea

Mota: Tesia

Teseo: 584174 DIALNET lock_openIdus editor

Laburpena

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica multifuncional que está implicada en procesos clave del metabolismo del carbono y del nitrógeno. Esta enzima está regulada por distintas modificaciones postraduccionales (PTMs), las cuales modifican la enzima y modulan su actividad de forma compleja. En cuanto a su degradación, una fracción de la cantidad total de PEPC se degrada por el sistema ubiquitina-proteasoma, pero no se ha descrito una ruta alternativa de degradación ni mecanismos de regulación de la misma. Este trabajo profundiza en los elementos reguladores de la estabilidad de la PEPC C4 fotosintética de sorgo, así como de las isoformas C3 de la misma. Para ello, se ha analizado la repercusión de las PTMs sobre la estabilidad de la proteína, y se ha estudiado el papel de la autofagia, selectiva y masiva, en la degradación de la PEPC. Numerosas evidencias experimentales muestran que existe una interacción entre la oxidación proteica, derivada de las especies reactivas de oxígeno (ROS), y la S-nitrosilación de proteínas, derivada del óxido nítrico (NO). Previamente se había descrito que el NO incrementaba la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa (PEPCK) en hojas de sorgo, fomentando la fosforilación de la PEPC fotosintética. En este trabajo, se ha encontrado en hojas de sorgo una interacción, in vitro e in vivo, entre la carbonilación de la PEPC C4, que la inactivaba, y la S-nitrosilación de la misma, que aumentaba la resistencia a la posterior carbonilación y, por tanto, preservaba su actividad. Además, en plantas sometidas a un choque salino, la carbonilación de la PEPC aumentó a la vez que la S-nitrosilación disminuyó. A continuación, se detectó un aumento de la S-nitrosilación de la PEPC acompañado de un descenso en la carbonilación. Estos resultados sugieren que la S-nitrosilación puede contribuir a mantener la actividad de la PEPC C4 en hojas de sorgo estresadas por sal. De este modo, la síntesis de NO inducida por la salinidad protegería a la PEPC fotosintética de la inactivación oxidativa. Al mismo tiempo, al promover su fosforilación, garantizaría el funcionamiento óptimo de la enzima en condiciones subóptimas. En plantas C3 existen varias rutas de degradación de componentes cloroplastídicos en la vacuola. Algunas de estas rutas están relacionadas con la autofagia y otras no. En ellas, la rubisco y otras proteínas son incluidas en vesículas que posteriormente se transportan a la vacuola y se degradan para reciclar el nitrógeno. Por otro lado, el ácido fosfatídico (PA) provoca la exposición del extremo C-terminal de la PEPC de tipo C4, reconocido por una proteasa. Cuando el PA se une a la proteína, induce el reclutamiento de ésta a membrana, acompañado de su inactivación. En maíz, la PEPC de tipo C4 se une a la membrana del cloroplasto al mismo tiempo que pierde su actividad. Esto sugiere que en plantas C4 la PEPC puede estar relacionada con las vías de degradación vacuolar de componentes del cloroplasto, ya que, al igual que la rubisco, constituye una fuente importante para el reciclaje de nitrógeno. La autofagia es un proceso muy conservado que se encarga de la degradación, masiva o selectiva, de componentes celulares a través de su encapsulación en vesículas de doble membrana, denominadas autofagosomas, y posterior degradación en la vacuola. La autofagia, al igual que la PEPC, tiene un papel principal en el metabolismo del carbono y el nitrógeno. Además, esta vía se activa en respuesta a la deficiencia de estos dos elementos. Como la actividad PEPC está estrictamente controlada postraduccionalmente, es probable que su degradación también se encuentre muy regulada. La autofagia selectiva constituye una vía de degradación precisa y controlada, y su regulación es dirigida por receptores de cargo como NBR1, cuyo principal sustrato de reconocimiento es la ubiquitina. La PEPC es monoubiquitinada in vivo, pero su función fisiológica aún no está clara. Esta PTM aumenta en raíces estresadas por amonio y en semillas en germinación, y éstos son procesos en los que la autofagia está implicada. En este trabajo, en primer lugar, se han desarrollado métodos para la detección y el estudio de la autofagia en sorgo; y, en segundo lugar, se ha investigado la degradación autofágica de la PEPC y su relación con la monoubiquitinación de la proteína de tipo C3. En sorgo, la autofagia se activó en condiciones de estrés salino, nutricional y oxidativo, y la visualización de autofagosomas mediante microscopía confocal y electrónica constituyó un método efectivo para monitorizarla. Las medidas de expresión de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b permitieron detectar la activación de la autofagia en condiciones de estrés oxidativo y estrés nutricional por deficiencia de carbono y fósforo, pero no por deficiencia de nitrógeno y hierro. El desarrollo de estos métodos abre la puerta al estudio de procesos relacionados con la autofagia en sorgo. Por el contrario, se encontró que la proteína vírica βC1 mostró interacciones inespecíficas que hacen que no sea una herramienta idónea para estudios de autofagia. Además, el péptido que contiene el dominio de unión a ATG8 de βC1 no interaccionó in vitro con la proteína ATG8a de arabidopsis, presumiblemente por requerir algún elemento adicional, como la fosforilación, para ello. Por lo tanto, tampoco es una herramienta útil para la detección de autofagosomas in vivo. Diversos resultados experimentales demostraron que una fracción de la proteína PEPC se procesa por la vía autofágica. Por un lado, se observó una disminución de la cantidad de PEPC en raíces de sorgo con déficit de nitrógeno y en células de Nicotiana benthamiana con déficit de carbono, condiciones en las que se activa la autofagia. El uso de inhibidores de la autofagia en estas condiciones bloqueó dicha degradación. Además, en líneas SALK de arabidopsis deficientes en proteínas autofágicas (líneas atg2 y atg5) se observó un aumento de la cantidad total de PEPC. Estos resultados sugieren que una parte del total de proteína PEPC es degradada por autofagia, siendo la primera ocasión en que se observa este tipo de degradación para la PEPC. En cuanto a la monoubiquitinación de la PEPC, disminuyó tras el uso de un activador de la autofagia, la trehalosa, en plantas de arabidopsis, y aumentó en plantas de arabidopsis atg2 y atg5. En células de N. benthamiana, donde la PEPC se encuentra principalmente desubiquitinada, el uso del 3-MA (inhibidor de la formación de autofagosomas) provocó un aumento significativo de esta PTM. Estos resultados sugieren que la monoubiquitinación de la PEPC sirve como marcaje para su degradación por autofagia, lo que constituiría la primera función descubierta para la monoubiquitinación de la PEPC que la relaciona con una ruta de señalización, en este caso degradativa. Por otro lado, la proteína NBR1, un receptor de cargo que participa en la autofagia, se unió a la PEPC en hojas de sorgo, en plantas de arabidopsis atg5, y en células de N. benthamiana en las que la autofagia se había inhibido con 3-MA. Además, NBR1 también interaccionó con una PEPC parcialmente degrada en hojas, raíces y semillas de sorgo, hojas y raíces de arabidopsis y células de N. benthamiana. Estos resultados implican a NBR1 como elemento conector entre la PEPC y la vía autofágica. Los resultados expuestos en este trabajo ponen de manifiesto una implicación de la S-nitrosilación en mantener la estabilidad de la PEPC de tipo C4 de hojas de sorgo, así como evidencian la degradación de la PEPC de tipo C3 vía autofagia. De forma similar, la PEPC C4 también podría degradarse por autofagia, aunque en este caso, la proteína no se monoubiquitina. Futuros experimentos podrán determinar si la interacción con el PA y el reclutamiento a membrana están relacionados con la inclusión de la proteína en vesículas de degradación vacuolar, al igual que la rubisco, para reciclar el nitrógeno.